張誠，丁建玲，吳永剛，買買提依明·托合提，董軍，王繼超，楊小朋

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊)

0 引言

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，又以WHO Ⅲ級(jí)及Ⅳ級(jí)高級(jí)別膠質(zhì)瘤最為多見，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后平均生存期約為14個(gè)月左右[1]。Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤預(yù)后不佳，生存期短，目前已成為治療一大難題。

膠質(zhì)瘤目前的治療策略仍以外科手術(shù)為主[2]，術(shù)后給予同步放化療等綜合治療。由于膠質(zhì)瘤具有浸潤性生長特性、易局部擴(kuò)散、容易復(fù)發(fā)、難治性等特點(diǎn)[3]，嚴(yán)重影響患者的治療效果及預(yù)后；尤其膠質(zhì)母細(xì)胞瘤現(xiàn)階段仍無有效治療措施，大多數(shù)患者術(shù)后短期復(fù)發(fā)、預(yù)后不佳、死亡率較高。

近些年來，隨著對(duì)膠質(zhì)瘤分子病理的不斷深入研究，人們逐漸意識(shí)到膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展或許與多個(gè)遺傳因素改變有關(guān)，例如基因突變、變異、缺失等。隨著分子病理學(xué)不斷發(fā)展及多個(gè)腫瘤分子標(biāo)記物被重視并深入研究，初步了解了膠質(zhì)瘤基因表達(dá)差異與預(yù)后有關(guān)。

目前新疆學(xué)者已有大量研究表明，新疆維吾爾族婦女為乳腺癌、宮頸癌的高發(fā)人群，其發(fā)病率、發(fā)病特點(diǎn)與漢族婦女相比有著顯著性差異。本文通過對(duì)新疆維吾爾族及漢族膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的回顧性研究，初步探討新疆維吾爾族、漢族腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在MGMT 、1p19q、IDH、P53 基因表達(dá)的差異性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本

選取新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科2018 年1 月至2019 年11 月共50 例膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤患者，倫理經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者手術(shù)均經(jīng)我科高年資神經(jīng)外科醫(yī)師完成，術(shù)后病理證實(shí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(見圖5)，同時(shí)術(shù)后立即將患者部分新鮮腫瘤組織標(biāo)本送至新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行分子病理學(xué)檢測(cè)。

本組病例共有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者50 例，其中男性21 例，女性29 例；年齡25-70 歲；其中漢族24 例、維吾爾族17 例、其他民族9 例。

1.2 方法

MGMT：焦磷酸測(cè)序和甲基化定性PCR 分析法檢測(cè)MGMT 基因啟動(dòng)子甲基化(見圖1)。

IDH1：IDH1 基因突變采用PCR 分析法測(cè)序(見圖2)。

1p19q：1p19q 缺失采用熒光PCR 毛細(xì)管電泳法(見圖3)。

P53：免疫組化SP 染色(見圖4)。

1.3 結(jié)果判定

MGMT 甲基化結(jié)果判定：(1)甲基化引物有擴(kuò)增而非甲基化引物無擴(kuò)增，則該樣品為完全甲基化；如果甲基化引物有擴(kuò)增而非甲基化引物也有擴(kuò)增，則該樣品為部分甲基化，仍視為甲基化陽性；(2)如果甲基化引物無擴(kuò)增而非甲基化引物有擴(kuò)增，則該樣品為無甲基化(圖1)。

IDH 結(jié)果判定：將PCR 測(cè)序得到的序列與IDH1/2 的原始序列進(jìn)行對(duì)比，分析特定的堿基位置是否發(fā)生突變(圖2)。

1p/19q 缺失結(jié)果判定：觀察組織各STR 位點(diǎn)峰圖情況并與外周血各STR 位點(diǎn)峰圖比較，主峰消失或者峰值減少50%以上判為該STR 位點(diǎn)存在缺失(圖3)。

P53：SP 免疫組化染色下陽性產(chǎn)物通常為棕色顆粒，p53 陽性為細(xì)胞核出現(xiàn)黃染，對(duì)切片中出現(xiàn)染色反應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為染色細(xì)胞數(shù)量超過10%(圖4)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，采用檢驗(yàn)，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGMT、1p19q、IDH、P53 在不同臨床特點(diǎn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中的表達(dá)情況

50 例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者其中男性21 例(42%)、女性29例(58%)，≤50 歲患者24 例(48%)、＞50 歲患者26 例(52%)、漢族患者24 例(48%)、維吾爾族患者17 例(34%)、其他民族9 例(18%)；MGMT 甲基化陽性患者41 例(82%)、1p19q 缺失患者15 例(30%)，IDH 突變患者18 例(36%)。

2.2 MGMT、1p19q、IDH、P53 表達(dá)之間相互關(guān)系

MGMT、1p19q、IDH、P53 之間的相互表達(dá)通過χ2檢驗(yàn)分析，如表2 所示，MGMT、1p19q、IDH、P53 相互之間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，說明各分子病理基因表達(dá)之間無協(xié)同相關(guān)性。

3 討論

3.1 MGMT

甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是一種DNA 修復(fù)蛋白，正常狀態(tài)下可以將DNA 上的鳥嘌呤O6 位點(diǎn)移除，使鳥嘌呤恢復(fù)正常，起到保護(hù)細(xì)胞、避免損傷的作用。目前用于腫瘤治療的烷化劑主要有：替莫唑胺(TMZ)、嘧啶亞硝脲(ACNU)、雙氯乙基亞硝脲(BCNU)等。TMZ、ACNU、BCNU 均作用于O6 位點(diǎn)的鳥嘌呤，而MGMT 能夠迅速移除O6 位點(diǎn)鳥嘌呤上的烷基化合物致使烷化劑殺腫瘤作用下降，從而導(dǎo)致腫瘤耐藥[4]。已有大量研究表明MGMT 活性降低能使膠質(zhì)瘤患者細(xì)胞對(duì)烷化劑藥物敏感性增強(qiáng)，隨后研究證實(shí)膠質(zhì)瘤中活性降低的最主要原因?yàn)镸GMT 基因啟動(dòng)子區(qū)-CpG 島甲基化。MGMT 甲基化的膠質(zhì)瘤患者對(duì)烷化劑藥物雙氯乙基亞硝脲和替莫唑胺更為敏感，同時(shí)MGMT 甲基化的膠質(zhì)瘤患者的總生存率明顯提高，患者有效生存期與MGMT 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)呈正相關(guān)關(guān)系[5]。

表1 MGMT、1p/19q、IDH、P53 表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者之間的單因素分析

表2 MGMT、1p19q、IDH、P53 之間相互關(guān)系

圖1 MGMT 結(jié)果：A.MGMT 陰性表達(dá)，B.MGMT 陽性表達(dá)

圖2 雜合395G/A IDH1 突變：箭頭顯示IDH1 基因密碼子132 CGT/CAT 雜合突變

圖3 1p19q 熒光PCR 結(jié)果

圖4 P53 結(jié)果：超過30%的細(xì)胞顯示出核陽性

圖5 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理圖片：A.病理常規(guī)圖片 B.免疫組化圖片

研究發(fā)現(xiàn)，具有MGMT 甲基化的膠質(zhì)瘤患者對(duì)放療和化療更敏感，并且具有更長的生存期。所有，MGMT 甲基化可作為主要預(yù)后標(biāo)記，還可以提示后期化療效果。本研究MGMT 甲基化患者共41 例(82%)，其中漢 族20 例(40%)、維吾 爾族13 例(26%)、其他民族8 例(16%)，如表1 所示，MGMT 在不同民族、不同性別、不同年齡各組中表達(dá)無差異性，雖然MGMT 甲基化為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后良好的指標(biāo)，但MGMT 甲基化在新疆維吾爾族、漢族膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中表達(dá)無明顯差異性，說明在新疆維吾爾族和漢族在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程一致、無差異性。

3.2 1p19q

現(xiàn)有研究表明少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤特征性表現(xiàn)為1p19q 聯(lián)合缺失，且1p19q 為少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤主要分子標(biāo)志物[6]。1p19q 缺失為1 號(hào)染色體短臂(1p)和19 號(hào)染色體長臂(19q)上發(fā)生的雜合性缺失。1p19q 聯(lián)合性缺失主要發(fā)生于少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，其中發(fā)生率為80-90%，在間變性少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞中約50-70%，在彌漫星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)生率約為15%，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)生率約為5%。在鑒別少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和混合性少突星型細(xì)胞瘤時(shí)，都應(yīng)進(jìn)行1p19q 聯(lián)合缺失檢測(cè)，從而有助于區(qū)分混合性膠質(zhì)瘤傾向于星型還是少突，這對(duì)于后續(xù)治療有指導(dǎo)意義。1p19q 雜合性缺失檢測(cè)可用于指導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及少突星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的個(gè)體化治療。含1p19q 聯(lián)合性缺失的患者對(duì)PCV 化療方案更為敏感，并且預(yù)后比較好；反之，患者對(duì)PCV 化療敏感性不高，并且預(yù)后較差[7]。

有研究表明[8]，可將lp19q 聯(lián)合缺失作為一項(xiàng)獨(dú)立預(yù)后影響因子，該研究同時(shí)還表明在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者當(dāng)中，lp19q 聯(lián)合缺失患者也具有比較好的預(yù)后。因此可將1p19q 聯(lián)合缺失作為判斷放化療敏感性及患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本組研究中1p19q 聯(lián)合性缺失患者為15 例，聯(lián)合性缺失患者占總患者30%，1p19q 缺失目前主要用于少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，但目前研究表明1p19q 聯(lián)合性缺失對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后也有一定指導(dǎo)意義；但本組研究中新疆漢族與維吾爾族1p19q 聯(lián)合缺失率分析中表達(dá)無差異性、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 IDH

異檸檬酸脫氫酶(IsocitrateDehydrogenase，IDH)為新陳代謝過程中的一種關(guān)鍵酶。IDHl/IDH2 基因突變導(dǎo)致IDH 催化異檸檬酸氧化脫羧成為α-酮戊二酸的能力喪失，同時(shí)使IDH 獲得了依賴NADPH 催化還原α 一酮戊二酸(α-KG)為2 羥基戊二酸(2HG)的能力。IDHl/IDH2 突變?cè)斐杉?xì)胞中2HG 的蓄積，過量的2HG可以直接抑制TET2 依賴α-KG 催化5-甲基胞嘧啶生成5-羥甲基胞嘧啶的能力，這是導(dǎo)致細(xì)胞具有過度甲基化表型的原因之一，從而影響腫瘤的發(fā)展[9]。已有相關(guān)研究表明，約12%的膠質(zhì)瘤患者存在IDH1 基因突變，且與腫瘤發(fā)生相關(guān)，故可將IDH1/IDH2 基因突變做為預(yù)后良好的重要標(biāo)志，大量研究表明，IDH1/IDH2 基因突變患者較野生型基因患者預(yù)后好[10]。

IDH1/IDH2 基因突變對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者的診斷和預(yù)后具有指導(dǎo)意義。表明膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與IDH1 突變具有相關(guān)性，隨后大量研究也證實(shí)IDH1 突變?cè)谀z質(zhì)瘤中具有普遍性。本研究中IDH 突變患者為18 例，突變率為36%，高于文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析IDH 突變率在新疆維吾爾族及漢族中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、P＞0.05。雖然IDH1/IDH2 突變對(duì)Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)價(jià)值[11]，但在新疆漢族與維吾爾族之間表達(dá)無差異性。

3.4 P53

P53 基因突變與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性，P53 基因同時(shí)也是迄今為止研究最廣泛、與人類腫瘤關(guān)系最密切的抑癌基因。目前多項(xiàng)研究表明，p53 的表達(dá)在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤[15-16]。P53 基因突變不僅在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用，同時(shí)還會(huì)降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)放化療的敏感性。Wang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)P53 基因突變降低同時(shí)可降低MGMT mRNA 的表達(dá)，使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性增強(qiáng)了5 倍。有研究表明，同時(shí)測(cè)定 MGMT 與P53 的表達(dá)有助于確定膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺是否敏感[18]，在本研究中如表2 所示，MGMT與P53 表達(dá)無相關(guān)性，與相關(guān)研究不相符。同時(shí)如表1 所示本研究中P53 表達(dá)在新疆維吾爾族及漢族群體中表達(dá)無明顯差異。

3.5 MGMT、1p19q、IDH、P53 表達(dá)之間相互關(guān)系

研究表明通過對(duì)MGMT、1p19q、IDH、P53 聯(lián)合檢測(cè)，可將膠質(zhì)瘤分為若干分子亞型[12]，通過對(duì)不同亞型的判斷，從而制定個(gè)體化治療方案，可使膠質(zhì)瘤患者的生存率及預(yù)后率不斷提高，因此聯(lián)合檢測(cè)MGMT 、1p/19q、IDH 對(duì)高級(jí)別膠質(zhì)瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷均有一定參考價(jià)值[13]。但在本研究中，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MGMT、1p19q、IDH、P53 相互表達(dá)之間無明顯相關(guān)性、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 展望

膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程涉及了很多基因水平的改變，是多基因、多因素共同作用的結(jié)果，目前尚無單一、特定的某一種分子標(biāo)志物可以單獨(dú)判斷患者預(yù)后，聯(lián)合檢測(cè)膠質(zhì)瘤多個(gè)分子標(biāo)記物將有助于提高判斷率及診斷率，這對(duì)高級(jí)別膠質(zhì)瘤的診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。

但本研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族、維吾爾族在MGMT、1p19q、IDH、P53 表達(dá)方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明新疆維吾爾族、漢族不同民族在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展及分子病理表達(dá)方面無明顯差異，故不可將MGMT、1p19q、IDH、P53 聯(lián)合檢測(cè)用于鑒別新疆不同民族之間表達(dá)差異，但可用于膠質(zhì)瘤預(yù)后指標(biāo)。本研究也存在諸多不足，如單中心、樣本量較少、檢測(cè)指標(biāo)較少、隨訪時(shí)間較短等，導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明新疆漢族、維吾爾族膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤表達(dá)之間無差異性，在隨后的研究中我們將不斷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充、驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。