余書平，徐禮羿，吳榮梅，王麗鴛，吳立赟，韋康，成浩*，汪永奇

浙江開化縣茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

余書平1，徐禮羿2，吳榮梅1，王麗鴛2，吳立赟2，韋康2，成浩2*，汪永奇1

1. 浙江省開化縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 開化 324300；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008

收集了浙江省開化縣的不同茶樹種質(zhì)資源，利用SSR標記對資源的遺傳多樣性及個體間的遺傳關(guān)系進行評估，篩選適于分子鑒別的核心標記組合，并分析樣本的親緣關(guān)系。研究結(jié)果顯示：（1）14個SSR標記在供試樣本中具有多態(tài)性，每個SSR位點的等位基因數(shù)為3~6個，平均等位基因數(shù)為4.14個，平均有效等位位點數(shù)為2.927個；（2）14個SSR位點的基因分型組合能精確的識別出每份種質(zhì)資源，基于復合位點分析，成功篩選出10個核心SSR位點作為簡化的組合，以該組合檢測本試驗的36份種質(zhì)資源，其PE-1和PE-3分別超過0.99，PE-2超過0.95；（3）基于UPGMA構(gòu)建進化樹，將36份樣本分為3個類群，并通過親緣分析初步推測樣本組中5個組合可能存在親子關(guān)系。研究表明開化的茶樹種質(zhì)資源具有區(qū)別于現(xiàn)有育成品種的遺傳背景，遺傳多樣性豐富。

SSR標記；遺傳背景；親緣分析；開化縣；茶樹

浙江省屬經(jīng)濟發(fā)達省份，但其山區(qū)面積達到717萬hm2，占全省土地面積的70.4%，山區(qū)縣市是經(jīng)濟發(fā)展相對緩慢的地區(qū)[1]。因此大力發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟是浙江省經(jīng)濟發(fā)展的重要部分。浙江省衢州市開化縣為典型的山區(qū)縣，生態(tài)環(huán)境優(yōu)越，具有豐富的茶樹資源[2]。茶樹是我國經(jīng)濟效益較高的作物[3]，對大力發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟，具有良好的效果。截至2013年，開化縣已發(fā)展8?000?hm2高山茶園，春茶總產(chǎn)量1?165?t，產(chǎn)值達到4.22億元[4]。但目前仍存在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一等問題限制了茶產(chǎn)業(yè)進一步的發(fā)展[5]。因此，收集開化縣地區(qū)的茶樹種質(zhì)資源，研究其遺傳背景和親緣關(guān)系是未來培育新品種茶樹，豐富茶類結(jié)構(gòu)和茶產(chǎn)品，以及進一步提升茶產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。

微衛(wèi)星標記（Simple sequence repeats，SSR）作為PCR技術(shù)分子標記的代表，在上世紀90年代末至21世紀初被廣泛應用于各種作物的遺傳研究中[6-7]。SSR是廣泛分布于真核生物基因組中的重復DNA片段（1~6?bp）[8]，具有共顯性、多態(tài)性高、易檢測、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，較之目前常用的SNP標記成本更為低廉，因此擁有極強的實用性[9]。目前，SSR標記已廣泛應用于茶樹的遺傳多樣性和遺傳圖譜等方面的研究[10-11]。王松琳等[12]利用62個SSR標記分析了白化和黃化茶樹資源的遺傳多樣性，并初步明確SSR標記在此類茶樹資源的適用性；王讓劍等[13]采用熒光標記的SSR建立了54個福建無性系茶樹品種的鑒別圖，實現(xiàn)品種的快速、穩(wěn)定鑒別。Chang等[14]結(jié)合SSR、RAPD和AFLP標記對79個單株的F1群體建立了1份包含309個標記的遺傳圖譜；徐禮羿等[15]利用SSR標記構(gòu)建的遺傳圖譜實現(xiàn)茶樹炭疽病的QTL分析，成功挖掘了8個與茶樹炭疽病相關(guān)的QTLs。

本研究通過15個SSR位點，分析浙江省開化縣茶樹資源的遺傳多樣性，旨在為開化縣茶樹資源構(gòu)建SSR指紋圖譜，篩選1組用于鑒別該地區(qū)種質(zhì)資源的核心SSR標記，并檢測其在指紋圖譜中的檢測能力，研究開化茶樹資源的遺傳背景，為后續(xù)新品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取浙江省開化縣的26份茶樹資源作為試驗材料，分別編號1—26，以種植于中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所嵊州基地的10個育成品種作為對照材料，分別編號27—36。取其新鮮的幼嫩組織置于–20℃下保存。供試樣品詳細信息見表1。

1.2 DNA提取

DNA提取使用改良CTAB法，待測樣品的組織材料經(jīng)液氮冷凍后，快速置于自動研磨儀中以30?r·s-1的速度研磨2?min，若材料未充分研磨可重新置于液氮中冷凍后再次研磨。研磨徹底的材料粉末采用植物基因組提取試劑盒（DP305 Plant Genomic DNA Kit，天根生化科技有限公司）提取DNA，詳細提取方法參照試劑盒說明書?；蚪M提取后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，使用超微量分光光度計（Nano Drop ND-1000，賽默飛世爾）測定DNA的濃度和純度；根據(jù)DNA的濃度將每份樣品DNA稀釋到20~30?ng·μL-1，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選SSR引物的PCR擴增

從課題組前期已構(gòu)建完成的遺傳圖譜[16]上挑選多態(tài)性高、條帶清晰的15對SSR引物（表2）對樣品DNA進行PCR擴增。

PCR反應體系：Reaction Mix 5.0?μL（含DNA Polymerase、2×PCR Buffer、MgCl2和dNTP）；模板DNA 2.0?μL；Primer-F、Primer-R（10?ng·μL-1）各0.2?μL，加ddH2O至10?μL。

PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性4?min；94℃變性30?s，最適退火溫度退火30?s，72℃延伸30?s，共計35個循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存（根據(jù)各個引物合成信息，Tm為52~58℃）。

表1 36份供試樣本信息表

1.4 擴增產(chǎn)物的PAGE電泳和銀染顯色

擴增產(chǎn)物加入2?μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer）混勻，進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），電泳在CBS MGV-202-33型垂直電泳儀上進行。電泳結(jié)束后進行銀染顯色，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像儀拍照，然后用保鮮膜將凝膠封存。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用人工讀帶的方法，將電泳圖上的目的片段范圍內(nèi)清晰的條帶，按照分子量大小，從大到小依次記作A、B、C、D…，單一條帶為純合基因型，兩條條帶為雜合基因型，因條帶的大小不同分別記錄為AA、AB、BB、AC、AD、CD等，條帶缺失記為“..”。得到的數(shù)據(jù)計入Excel表，建立起原始基因型數(shù)據(jù)矩陣。

表2 15對SSR引物信息

注：*未擴增出特異性條帶，在后續(xù)分析中排除

Note: * represented un-amplified band, which is excluded in subsequent analysis

利用GenAlEx 6.5.0.3軟件[17]進行基因頻率、雜合度、標記鑒別力等一系列遺傳參數(shù)的運算。首先，將原始基因型數(shù)據(jù)矩陣格式化為軟件所需的格式，Excel的第一行分別填寫位點數(shù)、樣本數(shù)、種群數(shù)及各個種群所含有的樣本數(shù)；Excel第一列為樣本編號，第二列為樣本對應的種群名，第3列起為標記列，每個標記占2列，將等位位點分列，并將基因型A、B、C…替換為數(shù)字形式的1、2、3…，缺失位點用“0”表示。

按照供試樣本的基因型數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)換成PowerMarker v3.25軟件[18]要求的數(shù)據(jù)格式，例如基因型“AA，AB，BB…”轉(zhuǎn)換為“1/1，1/2，2/2…”，缺失數(shù)據(jù)用“？”替代?；凇癗ei.1983”計算樣本間的遺傳距離并進行UPGMA進化樹構(gòu)建。使用FigTree v1.2.4軟件繪制UPGMA進化樹。

將按照供試樣本的基因型導入Cervus軟件[19]進行親緣分析，其中檢測樣本比例設(shè)定為0.95，檢測位點設(shè)定為0.8，缺失位點設(shè)定為0.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多態(tài)性

本試驗采用的14對SSR標記在26份開化茶樹資源的樣本中表現(xiàn)出中等水平的多態(tài)性，除標記CsFM1660（65%）以外，其余13對SSR標記均在超過88%的樣本中能成功擴增出目的片段（圖1，表3）。14個SSR標記共計擴增出58個等位基因，標記的等位位點范圍為3~6個，平均每個SSR標記擴增出4.14個等位位點，平均有效等位位點數(shù)為2.927個。標記CsFM1781、CsFM1835和CsFM1843擴增的等位基因較少，僅為3個；標記CsFM1735擴增的等位基因最多，達到6個（表4）。所選用的SSR標記超過70%（10對）在樣本組中具有鑒別出4個及以上等位基因的能力。

通過表3可以發(fā)現(xiàn)，本研究中SSR位點的有效位點數(shù)Ne與多態(tài)信息量I存在正相關(guān)，SSR位點擁有的有效等位位點數(shù)越多，其多態(tài)信息量越高。例如，在14個標記中，標記CsFM1735的有效等位位點數(shù)最多，達到4.380，其多態(tài)信息量（1.602）同樣為所有標記中的峰值。與之相反的，CsFM1737在樣本組中的有效等位位點數(shù)僅為1.688，為14個標記的最低值，其多態(tài)信息量（0.777）同樣為樣本組中的最低值。同時，本研究中CsFM1660、CsFM1671、CsFM1715、CsFM1735和CsFM1839等5個標記的有效標記數(shù)均超過3個，在樣本組中表現(xiàn)出的多態(tài)性較高，具有較強的鑒別能力。此外，標記CsFM1640、CsFM1651、CsFM1671、CsFM1714、CsFM1715、CsFM1717、CsFM1735、CsFM1737、CsFM1781、CsFM1835和CsFM1839等11個位點的觀測雜合度均高于0.5，表明這些位點在樣本組中呈現(xiàn)出中高度多樣性的特點，可以選用這11個SSR標記作為本試驗樣本組遺傳多樣性分析的核心標記組合。

在CsFM1640、CsFM1651、CsFM1714、CsFM1715、CsFM1735、CsFM1737和CsFM1835等7個位點中，固定系數(shù)F為負值，即Ho值略高于He值，表明在這些位點上存在輕微雜合子過量的情況。

2.2 指紋圖譜與標記的鑒別能力

利用GenAlEx軟件，將基因分型數(shù)據(jù)進行復合位點分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于14個SSR標記組合，36份供試樣本的數(shù)字化基因分型如圖2所示。本試驗的14個SSR標記鑒別結(jié)果顯示，編號17和18的兩個樣本具有相同的基因型，因此我們推測這兩個樣本的遺傳背景相同。此外，我們進一步計算了復合位點的非同一概率值PE（表5）。PE-1表示位點未缺失時的PE值，PE-2表示缺失1個位點的PE值，PE-3表示去除1個純合位點的PE值。由表5可知，14個SSR位點的PE-1值的范圍在0.212?1~0.588?8，均值為0.403?3；PE-2值的范圍在0.079?1~0.409?8，均值為0.244?0；PE-3值的范圍在0.352?7~0.771?3，均值為0.569?5；在位點未缺失的情況下，14個SSR位點組合后，兩個隨機樣本基因型組合不同的概率值（PE-1）為0.999?4；若缺失一個位點時，14個SSR位點組合后兩個隨機樣本基因型組合不同的概率（PE-2）為0.981?5；在去除一個純合位點的情況下，14個SSR位點組合后兩個隨機樣本基因型組合不同的概率（PE-3）為1.000?0。

圖1 標記CsFM1715的部分電泳條帶

表3 14對SSR標記的遺傳參數(shù)

表4 14個SSR標記在36份供試樣本中的位點頻率與位點數(shù)

注：條形碼編碼格式為code 39

基于表5可知，PE-1、PE-2和PE-3之間存在極顯著正相關(guān)。由圖3可知，隨著SSR位點組合從1個增加到14個，樣本組中隨機2個樣本具有不同基因型組合的概率值PE-1從0.442?5上升為0.999?4，PE-2從0.259?6上升為0.981?5，PE-3從0.595?9上升為1.000?0；因此，當我們選擇10個核心SSR標記組合時，PE-1和PE-3分別超過0.99，PE-2超過0.95。為了能夠用盡可能少的核心引物準確地識別本試驗的種質(zhì)資源，篩選出本試驗中PE值排名前10的標記作為核心標記，包括CsFM1640、CsFM1651、CsFM1660、CsFM1671、CsFM1714、CsFM1715、CsFM1717、CsFM1735、CsFM1757和CsFM1839。

2.3 親緣分析

基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建了36個供試樣品的UPGMA進化樹圖（圖4）。按遺傳距離的遠近，供試樣品可大致分為3個類群（Group 1、Group 2和Group 3）。Group 1共有9個樣本，包含1個育成品種龍井43，且樣本KH-2015-13與龍井43遺傳距離最近，推測其與龍井43親緣關(guān)系較近；樣本SZ-2和KH-2015-1之間遺傳距離相同，推測其遺傳背景極度近似或相同。Group 2共有15個樣本，包含烏牛早、白毫早、金萱、南江1號和農(nóng)抗早等5個育成品種；海順1號和海順2號、KH-2015-14和KH-2015-15為2個遺傳距離相等的組合，推測其遺傳背景極度近似或相同。Group 3共有12個樣本，包含福鼎大白、迎霜、中黃1號和中黃2號等4個育成品種。

表5 14個SSR標記的PE值

注：PE-1表示位點未缺失時的PE值，PE-2表示缺失1個位點的PE值，PE-3表示去除1個純合位點的PE值

基于UPGMA進化樹劃分的3個類群，分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）結(jié)果顯示（圖5），14個SSR位點的基因型頻率在樣本中的分子變異表現(xiàn)出組間（8%）＜組內(nèi)（14%）＜個體（78%），即按遺傳距離對樣本組進行分群可以發(fā)現(xiàn)，36份供試樣本的分子遺傳變異主要源于個體間。

采用Cervus軟件對各個樣本之間的親緣關(guān)系進行模擬分析可知，在置信度水平為80%和95%時，其Δ閾值分別為1.00和1.25，即樣本兩兩間的LOD值高于閾值時，表明二者存在該置信度水平下的親子關(guān)系。由表6可知，樣本SZ-2和KH-2015-1存在顯著的親子關(guān)系，且二者均與KH-2015-8存在親子關(guān)系。此外，樣本KH-2015-7和大龍黃化、KH-2015-11和KH-2015-22、KH-2015-18和KH-2015-19等3個組合存在親子關(guān)系。

3 討論

3.1 SSR標記的多樣性和檢測能力

本研究采用的SSR標記源于Tan等[20]開發(fā)的分子標記，已廣泛的應用于茶樹資源的分子指紋圖譜構(gòu)建和遺傳分析[21]。徐禮羿等[22]對勐庫大葉種茶樹進行SSR遺傳分析后認為，8個核心SSR標記即可成功識別200份以上的試驗材料。因此，本試驗初期選取15個SSR標記進行多樣性分析，結(jié)果顯示共有14個SSR標記具有多態(tài)性，標記的等位位點3~6個，平均每個SSR標記擴增出4.14個等位位點，平均有效等位位點數(shù)為3.08個。除初期排除的1個標記外，14個SSR標記的多態(tài)信息量均較高（I＞0.5），表明本研究選取的14個標記整體多態(tài)性較好，符合構(gòu)建指紋圖譜進行品種鑒定的要求?；趶秃衔稽c的非同一性分析發(fā)現(xiàn)，選擇10個核心SSR標記組合時，PE-1和PE-3分別超過0.99，PE-2超過0.95，即可實現(xiàn)對本試驗36份材料的成功識別。與Tan等[21]和徐禮羿等[22]的結(jié)果相比，本研究鑒定的材料較少，但需要增加2個核心標記才能實現(xiàn)資源的精確識別，結(jié)合親緣分析和進化樹圖，推測樣本之間親緣關(guān)系較近是導致該現(xiàn)象的原因，因此后續(xù)有待進一步開發(fā)更適合此類資源鑒別的多態(tài)性標記，降低用于鑒定的核心標記數(shù)，提高性價比。

圖4 36份供試樣本的UPGMA進化樹

注：Among Pops表示組間變異；Among Indiv表示組內(nèi)變異；Within Indiv表示個體間變異

表6 36份樣本的親緣分析

注：*表示相關(guān)性極顯著；+表示相關(guān)性顯著

Note: * indicated highly significant correlation, + indicated significant correlation

3.2 36份材料的親緣分析

本文基于Nei’s遺傳距離將供試樣本分為3個類群，Group 1中的樣品主要與對照品種龍井43的親緣關(guān)系較近，其中KH-2015-13與龍井43的親緣關(guān)系最為接近。此外，基于親緣分析，Group 1中樣本SZ-2和KH-2015-1之間存在顯著的親子關(guān)系，且二者均與KH-2015-8存在親子關(guān)系。由表1可知，SZ-2和KH-2015-8均種植于蘇莊鎮(zhèn)，而KH-2015-1種植于齊溪鎮(zhèn)大龍村，結(jié)合三者的遺傳分析和地理位置，推測SZ-2和KH-2015-8可能為KH-2015-1的父母本，KH-2015-1由蘇莊鎮(zhèn)引種至齊溪鎮(zhèn)大龍村。

Group 2中存在遺傳距離相等的2個組合，海順1號和海順2號、KH-2015-14和KH-2015-15。其中，海順1號和海順2號表型特征接近，均為特異的白化種質(zhì)資源（圖6-A），在未來研究中，可用于優(yōu)異白化品種的選育；基于KH-2015-14和KH-2015-15的基因分型可以發(fā)現(xiàn)，兩個樣本之間的14個標記基因分型完全相同，且兩個樣本表型相似，均有發(fā)芽特早的特點，推測兩個樣本源于同一親本茶樹。此外，Group 2中KH-2015-18和KH-2015-19之間存在顯著的親子關(guān)系。

親緣分析顯示Group 3中的樣本組合KH-2015-7和大龍黃化、KH-2015-11和KH-2015-22存在顯著的親子關(guān)系。其中KH-2015-11和KH-2015-22均具有葉色黃綠的特征。此外，作為對照樣本的10個育成品種分布于3個類群之中，除龍井43和中黃2號外，其余8個品種與26份開化的茶樹種質(zhì)資源遺傳距離較遠，表明開化的茶樹資源具有區(qū)別于現(xiàn)有育成品種的遺傳背景，遺傳多樣性豐富，這與表型觀測結(jié)果一致。表型性狀觀測發(fā)現(xiàn)，開化的茶樹種質(zhì)資源中具有白化（圖6-A）、黃化（圖6-B）和紫化的特異種質(zhì)資源，本研究結(jié)果對未來開化地區(qū)特異性狀茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)和選育具有重要意義。

圖6 海順1號（A）和KH-2015-13（B）的表型特征

本研究基于14個SSR分子標記，分析浙江省開化縣26份有性群體種茶樹種質(zhì)資源和10個育成茶樹品種之間的親緣關(guān)系，并構(gòu)建SSR指紋圖譜，進一步篩選出10個核心SSR位點作為簡化的組合，在位點未缺失的情況下，識別率可達99%以上，在缺失1個位點的情況下，識別率也可達到95%；結(jié)合群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，36份供試樣本被分為3個類群，并初步推測樣本組中存在親子關(guān)系的5個組合。綜上，本文分析了開化縣26份茶樹種質(zhì)資源的遺傳背景，為該地區(qū)未來新品種選育及種質(zhì)資源保存提供了研究基礎(chǔ)。

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Genetic and Phylogenetic Analysis for Resources offrom Kaihua County in Zhejiang Province

YU Shuping1, XU Liyi2, WU Rongmei1, WANG Liyuan2, WU Liyun2, WEI Kang2, CHENG Hao2*, WANG Yongqi1

1. Bureau of Agriculture and Rural Affairs of Kaihua, Kaihua 324300, China 2. National Centre for Tea Improvement, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In this study, various tea resources from Kaihua County were collected to evaluate genetic diversity and phylogenetic relationships among individuals by SSR markers. Meanwhile, suitable core marker combinations were screened to construct fingerprint map. The results show that: (1) 14 SSR markers were polymorphic in the samples. The number of alleles per SSR locus was from 3 to 6 with the mean value of 4.14, and the average number of effective alleles was 3.08. (2) each germplasm resource could be identified by using 14 SSR markers. And based on the analysis of complex loci, the value of PE-1 and PE-3 were over 0.99 and PE-2 over 0.95, respectively, when 10 core SSR loci, as a simplified combination, were successfully screened to distinguish 36 germplasm resources. (3) 36 samples were divided into three groups based on UPGMA phylogenetic tree, and it was preliminarily speculated that five combinations might have parent-child relationship in the sample group through phylogenetic analysis. Present study indicated that tea germplasms in Kaihua County displayed highly diverse genetic backgrounds and might provide useful plant resources for breeding of new cultivars.

SSR marker, genetic background, phylogenetic analysis, Kaihua County,

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2020)03-341-11

2019-09-18

2019-10-20

中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610212018004）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項（2016C02053）

余書平，男，高級農(nóng)藝師，主要從事茶樹資源、茶葉加工方面的研究。*通信作者：chenghao@tricaas.com

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