徐燕，蔡嚇強(qiáng)，解千金，邰玲玲，劉增輝

表沒食子兒茶素沒食子酸酯和維生素C聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的影響

徐燕1,2，蔡嚇強(qiáng)1,2，解千金1,2，邰玲玲1,2，劉增輝3

1. 茶樹生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；3. 安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061

以KM雄性小鼠為研究對(duì)象，酵母膏（7.5?g·kg-1）和氧嗪酸鉀（250?mg·kg-1）聯(lián)合給藥建立高尿酸血癥小鼠模型，探究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和維生素C（Vc）聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的影響。將小鼠隨機(jī)分為6組（n=6）：空白組、模型組、別嘌呤醇組（陽(yáng)性藥組）、EGCG組、EGCG聯(lián)合Vc組和Vc組，連續(xù)給藥7?d后測(cè)定生化指標(biāo)。結(jié)果表明，與模型組相比，EGCG聯(lián)合Vc組小鼠的血尿酸值（UA），血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平均明顯降低（<0.001）；EGCG與Vc聯(lián)用明顯抑制了肝臟中腺苷脫氨酶（ADA）和黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性（<0.05或<0.01），并顯著下調(diào)了腎臟中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（GLUT9）mRNA的表達(dá)（<0.001）；腎臟切片顯示EGCG和Vc聯(lián)用顯著改善高尿酸血癥小鼠的腎臟損傷。此外，EGCG與Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠的作用效果優(yōu)于EGCG。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；維生素C；高尿酸血癥；血尿酸；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是一種代謝性疾病，其特點(diǎn)是血液中尿酸水平過高，且在腎臟和關(guān)節(jié)中有尿酸鹽結(jié)晶沉淀。尿酸濃度過高會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷。研究發(fā)現(xiàn)10% HUA會(huì)自然發(fā)展為痛風(fēng)，HUA還會(huì)增加心血管疾病、糖尿病、慢性腎病等代謝綜合征的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1-4]。目前臨床上主要使用別嘌呤醇（Allopurinol，AP）等藥物治療HUA，但其在降尿酸的同時(shí)往往伴隨有許多毒副作用，甚至?xí)l(fā)腎衰竭等超敏反應(yīng)[5]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶茶多酚中兒茶素的主要成分，占兒茶素總量的50%以上。EGCG具有很好的抗氧化、抗炎、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功能[6-8]。但是EGCG的穩(wěn)定性不好，在血液以及胃腸道中極易發(fā)生氧化、異構(gòu)、聚合和降解等反應(yīng)，生物利用度較低[9-10]。維生素C（Vitamin C，Vc）是一種天然抗氧化劑，也是一種水溶性自由基清除劑，在體內(nèi)能夠去除羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）等。研究發(fā)現(xiàn)，Vc能抑制兒茶素的異構(gòu)化反應(yīng)，提高兒茶素的穩(wěn)定性[11]。

高尿酸血癥形成主要因素有兩個(gè)方面：一是尿酸生成過多；二是尿酸排泄減少。尿酸經(jīng)腎小球?yàn)V過后，僅有8%~12%的尿酸排出體外，絕大部分尿酸又被腎小管重吸收。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT9）是負(fù)責(zé)腎小管尿酸重吸收的關(guān)鍵蛋白，對(duì)維持機(jī)體血尿酸水平有重要作用[12]。本研究利用氧嗪酸鉀和酵母膏建立高尿酸血癥模型，旨在探究EGCG與Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的影響，為高尿酸血癥的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

EGCG（純度≥95%），購(gòu)于江蘇德和生物科技有限公司；Vc（純度≥99%），購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；氧嗪酸鉀，購(gòu)于都萊生物技術(shù)有限公司；酵母膏，購(gòu)于奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；別嘌呤醇，購(gòu)于信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司；尿酸、腺苷脫氨酶、黃嘌呤氧化酶、肌酐、蛋白、尿素氮試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；水合氯醛，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNA裂解液、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量試劑盒，購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；HE染色試劑盒，購(gòu)于博士德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

小鼠規(guī)格：SPF級(jí)雄性昆明種，體質(zhì)量(25±2)?g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCX（京）2016-0011。飼養(yǎng)條件：12?h光照∶12?h黑暗的環(huán)境，相對(duì)濕度(50±10)%；溫度(23±2)℃；自由攝食并飲水，SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.3 儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德有限公司）；ASP200S組織脫水機(jī)、EG1150H包埋機(jī)、RM2255切片機(jī)、ICC50W光學(xué)顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）；NANODROP 1000核酸定量?jī)x（賽默飛世爾科技有限公司）；PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高尿酸血癥小鼠模型的建立

解剖當(dāng)天給藥前1?h，給小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀（劑量為250?mg·kg-1）并灌胃酵母膏（劑量為7.5?g·kg-1）進(jìn)行造模。灌胃量根據(jù)小鼠體質(zhì)量來(lái)計(jì)算，計(jì)算公式：

灌胃量=小鼠體質(zhì)量×劑量÷濃度

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將36只小鼠隨機(jī)分成空白組（NC）、HUA模型組（MC）、陽(yáng)性藥組（5?mg·kg-1，AP）、EGCG組（20?mg·kg-1，E）、EGCG聯(lián)合Vc組（1∶1，20?mg·kg-1，E＋Vc）、Vc組（20?mg·kg-1，Vc），每組6只。

小鼠適應(yīng)1周后，夜間禁食12?h，次日清晨空白組和模型組灌胃生理鹽水，陽(yáng)性藥組注射別嘌呤醇，給藥組分別灌胃EGCG水溶液、EGCG與Vc（1∶1）混合水溶液以及Vc水溶液，連續(xù)灌胃6?d。第7天除空白組灌胃生理鹽水外，其他組按照1.2.1章節(jié)方法造模，造模1?h后空白組和模型組灌胃生理鹽水，陽(yáng)性藥組注射別嘌呤醇，給藥組分別灌胃EGCG水溶液、EGCG與Vc混合水溶液以及Vc水溶液。給藥后1?h麻醉小鼠摘眼球取血，斷頸處死后解剖取肝臟和腎臟組織。

1.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 血清中的指標(biāo)測(cè)定

全血樣本在室溫靜置1?h后，4℃下5?000?r·min-1離心10?min，取上層血清，按照試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定血清中尿酸（UA）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）含量。

1.3.2 肝臟中的指標(biāo)測(cè)定

解剖時(shí)觀察肝臟有無(wú)病變，快速用冰生理鹽水沖洗，4℃預(yù)冷后–20℃保存。按照組織重量（g）∶生理鹽水體積（mL）=1∶9的比例稱取0.2?g肝臟組織并加入預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，得到10%肝臟組織勻漿液，4℃下3?000?r·min-1離心10?min，取上清液，按照試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定肝臟組織中腺苷脫氨酶（ADA）、黃嘌呤氧化酶（XOD）和蛋白含量。

1.3.3 腎組織切片的制備和觀察

小鼠腎組織由冰的生理鹽水快速洗滌后浸泡于10%福爾馬林中，放于4℃冰箱保存。待組織固定后，用0.1?mol·L-1的PBS緩沖液（pH為7.4）充分清洗30?min，重復(fù)3次；然后在不同比例乙醇（70%、80%、90%和100%）中依次浸泡脫水，再經(jīng)二甲苯過渡后浸泡在石蠟中；用石蠟包埋組織，待石蠟冷卻后將組織切成4?μm厚的組織切片；經(jīng)40℃水浴展片后撈至載玻片上，45℃烤片5~6?h，按照HE染色試劑盒說(shuō)明書染色后用中性樹膠封片并在37℃烘6~7?h；光學(xué)顯微鏡下放大400倍觀察。

1.3.4 基因表達(dá)水平的測(cè)定

將小鼠腎組織快速用冰的生理鹽水沖洗，剪碎后浸泡于RNAstore Reagent中，4℃過夜后，–20℃保存。取RNAstore Reagent保存的組織按照Total RNA Extraction Reagent使用說(shuō)明提取小鼠腎組織總RNA。通過核酸定量?jī)x得到OD260/OD280、OD260/OD230、RNA質(zhì)量濃度（ng·μL-1），并根據(jù)OD260/OD280和OD260/OD230判斷RNA純度。

按照HiScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明將提取的小鼠腎組織總RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。PCR反應(yīng)體系為20?μL：2×RT Mix 10?μL，HiScript? Enzyme Mix 2?μL，Random hexamers（50?ng·μL-1）1?μL，cDNA模板和RNase free ddH2O 7?μL。反應(yīng)條件：25℃ 5?min，50℃ 55?min，85℃ 5?min，4℃最終延伸。每個(gè)樣品的總RNA量均為1.5?μg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠血清UA水平的影響

圖1表明，與NC組相比，MC組小鼠的血清UA值顯著升高（<0.01），說(shuō)明高尿酸血癥小鼠模型建立成功。與MC組相比，AP組小鼠的UA值極顯著下降了41.58%（<0.001），EGCG組與EGCG＋Vc組小鼠的UA值分別顯著下降了20.94%（<0.01）和26.99%（<0.001）。其中EGCG＋Vc組小鼠的UA值明顯低于EGCG組，且接近于NC組小鼠的尿酸水平。與MC組相比，Vc組小鼠的UA值下降未達(dá)到顯著水平。由此可見，EGCG與Vc聯(lián)用具有更好的降尿酸作用。

2.2 EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠血清BUN和Cr水平的影響

如圖2-A所示，與NC組相比，MC組小鼠的血清BUN水平極顯著升高（<0.001）。與MC組相比，AP組（<0.001）、EGCG組（<0.01）和EGCG＋Vc組（<0.001）小鼠的血清BUN水平均有顯著下降，Vc組小鼠的血清BUN水平雖有下降但差異未到達(dá)顯著水平。EGCG和Vc聯(lián)用組小鼠血清BUN水平低于EGCG組和Vc組。

如圖2-B所示，與NC組相比，MC組小鼠的血清Cr水平明顯升高（<0.05）。與MC組相比，AP組和EGCG＋Vc組小鼠的血清Cr水平極顯著下降（<0.001），而EGCG組和Vc組小鼠的血清Cr水平下降不明顯。由此表明，EGCG和Vc的聯(lián)用能促進(jìn)高尿酸血癥小鼠血清Cr水平的降低。

表1 基因特異性PCR引物序列

注：AP：別嘌呤醇（5?mg·kg-1）；E：EGCG（20?mg·kg-1）；E＋Vc：EGCG（20?mg·kg-1）＋Vc（20?mg·kg-1）；Vc：Vc（20?mg·kg-1）；與空白組（NC）相比，## P<0.01；與模型組（MC）相比，** P<0.01，*** P<0.001

2.3 EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟ADA和XOD活性的影響

如圖3-A所示，與NC組相比，MC組小鼠肝臟中的ADA活性極顯著升高（<0.001）。與MC組相比，AP組小鼠肝臟中的ADA活性極顯著降低（<0.001）；EGCG組小鼠肝臟中的ADA活性僅降低了11.64%，未達(dá)到顯著差異；EGCG＋Vc組小鼠肝臟中的ADA活性下降了21.98%，達(dá)到顯著差異（<0.01）。而Vc對(duì)小鼠肝臟組織中ADA的活性抑制作用差異不顯著。由此可見，EGCG和Vc的聯(lián)用可顯著抑制高尿酸血癥小鼠肝臟組織中ADA的活性。

如圖3-B所示，與NC組相比，MC組小鼠肝臟中的XOD活性顯著升高（<0.01）。與MC組相比，AP組和EGCG＋Vc組小鼠肝臟中的XOD活性明顯下降（<0.05），而EGCG組和Vc組小鼠肝臟中的XOD活性下降不明顯。由此說(shuō)明，EGCG和Vc的聯(lián)用可抑制高尿酸血癥小鼠肝臟組織中XOD的活性。

注：E：EGCG（20?mg·kg-1）；E＋Vc：EGCG（20?mg·kg-1）＋Vc（20?mg·kg-1）；Vc：Vc（20?mg·kg-1）；與空白組（NC）相比，# P<0.05，### P<0.001；與模型組（MC）相比，** P<0.01，*** P<0.001

注：E：EGCG（20?mg·kg-1）；E＋Vc：EGCG（20?mg·kg-1）＋Vc（20?mg·kg-1）；Vc：Vc（20?mg·kg-1）；與空白組（NC）相比，## P<0.01，### P<0.001；與模型組（MC）相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001

2.4 EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9表達(dá)的影響

圖4顯示，與NC組相比，MC組小鼠腎臟組織中的表達(dá)量顯著升高（<0.01）。與MC組相比，AP組（<0.001）、EGCG組（<0.01）、EGCG＋Vc組（<0.001）和Vc組（<0.05）小鼠腎臟組織中的表達(dá)量均顯著下調(diào)（<0.001，<0.01，<0.001，<0.05）。其中EGCG＋Vc組小鼠腎臟組織中的表達(dá)量明顯低于EGCG組和Vc組。由此說(shuō)明，EGCG和Vc均有下調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟組織中表達(dá)量的作用，且二者聯(lián)合作用效果能達(dá)到陽(yáng)性藥組水平。

2.5 EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠腎臟組織形態(tài)的影響

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠部分腎小球囊腔縮小，球囊黏連；腎小管管腔擴(kuò)張，部分上皮細(xì)胞扁平并脫落，空泡變性嚴(yán)重；腎間質(zhì)部分有炎癥因子浸潤(rùn)，腎臟損傷嚴(yán)重。與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥組小鼠腎臟仍有部分球囊黏連；腎小管管腔擴(kuò)張嚴(yán)重，部分呈空泡變性，腎臟損傷未得到顯著改善。EGCG組和EGCG+Vc組的小鼠腎小球形態(tài)基本恢復(fù)正常，腎小管管腔擴(kuò)張均有改善，空泡變性數(shù)量減少，但EGCG和Vc聯(lián)用組小鼠腎小管擴(kuò)張顯著改善，空泡變性數(shù)量明顯降低。Vc組小鼠的腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，但是腎小管管腔擴(kuò)張和空泡變形狀態(tài)并未得到明顯改善。研究結(jié)果表明EGCG和Vc聯(lián)用能顯著改善高尿酸血癥小鼠的腎臟損傷。

3 討論

尿酸是在肝臟中產(chǎn)生，經(jīng)由腎臟和腸道進(jìn)行排泄。在肝臟中，人體各種代謝產(chǎn)生的腺嘌呤核苷酸在ADA催化下生成次黃嘌呤，次黃嘌呤被XOD逐步分解后以尿酸鹽形式存在于血液中。因此，嘌呤代謝的紊亂會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)尿酸生成量增加或者尿酸排泄與分解量減少，尿酸在體內(nèi)的積蓄加重后會(huì)引發(fā)高尿酸血癥[13]。研究表明，酵母膏可通過增加機(jī)體內(nèi)蛋白的攝入量引發(fā)嘌呤代謝的紊亂[14]。本研究利用酵母膏聯(lián)合尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀在小鼠體內(nèi)建立高尿酸血癥模型，結(jié)果顯示小鼠的血清UA、BUN和Cr水平均顯著高于空白組，說(shuō)明模型建立成功。

前期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)高尿酸血癥小鼠有降尿酸的作用[15]。但是EGCG的穩(wěn)定性差，生物利用度較低。本試驗(yàn)進(jìn)一步探究了EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的影響。結(jié)果顯示，與EGCG單獨(dú)給藥組相比，EGCG和Vc聯(lián)用對(duì)高尿酸血癥小鼠的血清UA、BUN和Cr水平均有顯著降低作用。且EGCG與Vc聯(lián)用降低高尿酸血癥小鼠血清UA的效果優(yōu)于EGCG單用。ADA和XOD是參與肝臟中尿酸產(chǎn)生的兩種關(guān)鍵酶。分別灌胃EGCG和Vc后，高尿酸血癥小鼠肝臟組織中的ADA和XOD活性并未發(fā)生顯著降低，而EGCG和Vc聯(lián)合給藥后小鼠肝臟組織中的ADA和XOD活性顯著降低。這表明Vc和EGCG聯(lián)用可顯著抑制肝臟中ADA和XOD活性，減少尿酸的生成。

注：E：EGCG（20?mg·kg-1）；E＋Vc：EGCG（20?mg·kg-1）＋Vc（20?mg·kg-1）；Vc：Vc（20?mg·kg-1）；與空白組（NC）相比，### P<0.001；與模型組（MC）相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001

注：A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：陽(yáng)性藥組（AP，5?mg·kg-1）；D：EGCG（20?mg·kg-1）；E：EGCG（20?mg·kg-1）＋Vc（20?mg·kg-1）；F：Vc（20?mg·kg-1）。a：球囊黏連；b：管腔空泡變性；c：炎癥因子浸潤(rùn)

是一種參與尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因，主要在人和小鼠的近端小管以及小鼠腎臟的遠(yuǎn)端小管中表達(dá)。在尿酸代謝過程中，可以在肝細(xì)胞機(jī)體外側(cè)模上表達(dá)，從而將尿酸從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中[16]。除此之外，還能促進(jìn)尿酸在腎臟的重吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)灌胃EGCG或Vc相比，EGCG與Vc聯(lián)合給藥可顯著下調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟中的表達(dá)，從而有助于降低血液中的尿酸水平。從小鼠腎臟HE染色結(jié)果來(lái)看，別嘌呤醇雖然具有良好的降尿酸作用，但是未能明顯改善小鼠腎臟損傷。EGCG組和Vc組對(duì)高尿酸血癥小鼠的腎臟損傷均有不同程度的改善，但是二者聯(lián)用顯著地改善高尿酸血癥小鼠的腎臟損傷，腎小球和腎小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常。

綜上所述，EGCG和Vc聯(lián)用能顯著降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，改善高尿酸血癥小鼠的腎臟損傷，且EGCG和Vc聯(lián)用的效果優(yōu)于EGCG單用的效果。其原因可能是由于Vc提高了EGCG在體內(nèi)的穩(wěn)定性和生物利用度，從而提高EGCG的生物活性。因此EGCG與Vc的聯(lián)用對(duì)預(yù)防和治療高尿酸血癥具有重要的意義，其潛在的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步深入研究。

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The Intergative Effects of Epigallocatechin-3-gallate and Vitamin C on Serum Uric Acid Levels in Hyperuricemic Mice

XU Yan1,2, CAI Xiaqiang1,2, XIE Qianjin1,2, TAI Lingling1,2, LIU Zenghui3

1. State Key Laboratory of Tea Biology and Utilization, Hefei 230036, China; 2. School of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 3. Anhui Academy of Medical Science, Hefei 230061, China.

KM male mice were used as subjects of the study. Yeast extracts (7.5?g·kg-1) and potassium oxonate (250?mg·kg-1) were administered to establish the hyperuricemic mice model. The study aimed to investigate the integrative effect of EGCG and vitamin C (Vc) on serum uric acid levels of hyperuricemic mice. Mice were randomly divided into 6 groups (n=6): blank group, model group, allopurinol group, EGCG group, EGCG + Vc group and Vc group. The biochemical indexes of mice were measured after 7?d of continuous administration. The results show that the serum uric acid (UA), serum urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr) of EGCG + Vc group were significantly lower than those of the model group (<0.001). The combination of EGCG and Vc could remarkably inhibited the activities of adenosine deaminase (ADA) and xanthine oxidase (XOD) in the liver (<0.05 or<0.01) and significantly down-regulated the expression of glucose transporter 9 (GLUT9) in the kidney (<0.001). The results of kidney slices indicated that EGCG + Vc could obviously improve the damages to the kidney in hyperuricemic mice. In addition, the integrative effect of EGCG + Vc on hyperuricemic mice was better than that of EGCG.

EGCG, ascorbic acid, hyperuricemia, serum UA, GLUT9

S571.1；R983+.2

A

1000-369X(2020)03-407-08

2020-01-17

2020-02-06

安徽省自然科學(xué)基金（1908085MC74）、安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202004h07020003）、安徽省茶葉化學(xué)與健康領(lǐng)軍人才團(tuán)隊(duì)引進(jìn)重大示范項(xiàng)目

徐燕，女，副教授，主要從事茶學(xué)和食品科學(xué)方面的教學(xué)和科研工作，yanxu@ahau.edu.cn

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