蔣君梅，方遠(yuǎn)鵬，寧娜，陳美晴，楊再福，王勇，李向陽(yáng)，謝鑫*

茶樹(shù)基因克隆及表達(dá)分析

蔣君梅1，方遠(yuǎn)鵬1，寧娜1，陳美晴1，楊再福1，王勇1，李向陽(yáng)2*，謝鑫1*

1. 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 精細(xì)化工研究開(kāi)發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025

基因家族可編碼一類小分子的熱激蛋白，廣泛分布于植物中，具有分子伴侶的功能，在植物抵抗逆境脅迫中起著重要作用。通過(guò)基因克隆的方法，獲得1個(gè)茶樹(shù)基因的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF），其全長(zhǎng)480?bp，編碼159個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，CssHSP18.1蛋白含有1個(gè)典型HSP20結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量約為18.25?kDa，等電點(diǎn)為5.68，偏酸性，與櫟和蘋果親緣關(guān)系最近，無(wú)信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)。RT-qPCR分析表明，在甘露醇（-Mannitol）處理下表達(dá)量低于對(duì)照組；-氨基丁酸（GABA）能促進(jìn)該基因的表達(dá)，在處理后1?h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值；吲哚乙酸（IAA）和聚乙二醇（PEG 6000）處理后，在0.5?h時(shí)表達(dá)量最高，即GABA、IAA、PEG 6000均可誘導(dǎo)的表達(dá)。為獲得CssHSP18.1可溶性蛋白，構(gòu)建了pET-28a-CssHSP18.1重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，并分別對(duì)表達(dá)菌株、誘導(dǎo)溫度以及IPTG（異丙基---硫代吡喃半乳糖苷）誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白最佳表達(dá)菌株為BL21（DE3），最佳誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度分別為30℃和1.2?mmol·L-1。最后，采用Western blot對(duì)表達(dá)的CssHSP18.1蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為進(jìn)一步揭示基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

茶樹(shù)；；基因克?。簧镄畔W(xué)分析；脅迫；表達(dá)分析

茶樹(shù)（）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]，在種植過(guò)程中易受高溫、低溫和干旱等脅迫，從而影響茶樹(shù)生長(zhǎng)、茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。因此，對(duì)茶樹(shù)進(jìn)行抗性機(jī)制及抗性基因的研究具有重要意義。

分子伴侶（Molecular chaperones）是一類在細(xì)胞質(zhì)中能識(shí)別并結(jié)合不完整折疊或裝配的蛋白質(zhì)，能夠幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)，但其本身不參與最終產(chǎn)物的形成[3]。據(jù)報(bào)道，分子伴侶廣泛分布于動(dòng)植物及微生物中，在其生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，包括維持發(fā)育穩(wěn)定[4]，調(diào)節(jié)植物抗病過(guò)程[5]，應(yīng)對(duì)逆境脅迫（高溫[6]、高鹽[7]、干旱[8]等），以及病原耐熱性[9]等。熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是分子伴侶的一種，當(dāng)有機(jī)體暴露在高溫下，機(jī)體為保護(hù)自身由熱激發(fā)合成的一類蛋白質(zhì)，現(xiàn)泛指因逆境誘導(dǎo)而產(chǎn)生的蛋白。一些HSPs蛋白具有分子伴侶功能，在植物受到脅迫時(shí)，可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，在保護(hù)植物免受脅迫損害中起重要作用[10]。在正常狀態(tài)下HSPs含量?jī)H占蛋白總量的5%，但當(dāng)受到外界脅迫時(shí)，含量會(huì)迅速升高，可達(dá)到蛋白總量的15%[11-12]。根據(jù)蛋白質(zhì)大小分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSPs 5種類型[13]。

小分子熱激蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）是一類分子量為20?kDa左右的蛋白，故又被統(tǒng)稱為sHSP20[14]，sHSPs家族成員擁有1個(gè)約90個(gè)氨基酸組成的晶體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD結(jié)構(gòu)域，-crystallin domain，或稱HSP20結(jié)構(gòu)域）[15]。在細(xì)胞中，sHSPs蛋白起著對(duì)生物體在脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的不穩(wěn)定蛋白進(jìn)行“搶修”的作用[16]。植物sHSPs參與多種生理過(guò)程，包括抵御逆境[17-18]、預(yù)防不成熟蛋白聚集等[19]。目前在番茄（）[20]、甘蔗（）[21]、馬鈴薯（）[22]、核桃（）[23]、擬南芥（）[24]、西瓜（）[25]、百合（）[26]等植物中均有研究報(bào)道。在茶樹(shù)中已克隆了、、和等小分子熱激蛋白基因[27]，但對(duì)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)克隆了1個(gè)茶樹(shù)基因，采用RT-qPCR對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，并通過(guò)原核表達(dá)方法進(jìn)行蛋白表達(dá)，最后對(duì)蛋白可溶性表達(dá)條件進(jìn)行探索，研究結(jié)果為CssHSP18.1蛋白生物學(xué)功能研究及晶體結(jié)構(gòu)解析提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茶樹(shù)品種為福鼎大白茶，為室內(nèi)盆栽，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：晝/夜溫度28℃/21℃，光周期12?h/12?h，相對(duì)濕度70%~80%，光照強(qiáng)度260?μmol·m-2·s-1。

1.2 供試試劑

Pfu高保真酶購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司、限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳相關(guān)試劑均購(gòu)自北京酷來(lái)博科技有限公司；感受態(tài)細(xì)胞JM109（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLys、Tuner（DE3）購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；一抗Anti His和二抗（羊抗小鼠）均購(gòu)自北京聚合美生物公司；RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET-28a為貴州大學(xué)植物病理教研室保存。

1.3 供試儀器

PCR擴(kuò)增采用Bio-rad T-100梯度PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司）；蛋白免疫印跡試驗(yàn)采用天能5200化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（上海天能科技有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳采用聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；ZWYR-D2402型號(hào)搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），細(xì)胞超聲波破碎儀（美國(guó)Sonics公司）。

1.4 茶樹(shù)CssHSP18.1基因克隆與重組載體構(gòu)建

1.4.1 總RNA的提取與cDNA的反轉(zhuǎn)錄

取茶樹(shù)葉片材料，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA，試驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.2基因ORF克隆

以cDNA為模板，使用引物CssHSP18.1-F/ CssHSP18.1-R（表1）對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)參考基因序列（KU963241.1），通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均委托北京擎科生物科技有限公司完成。

PCR擴(kuò)增體系如下：Pfu 1?μL、cDNA1?μL、2.5?mmol·L-1dNTPs 4?μL、上下游引物各1?μL、5×buffer 10?μL、ddH2O 32?μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃2?min；95℃20 s，58℃20 s，72℃30?s，32個(gè)循環(huán)。

1.4.3 構(gòu)建pET-28aCssHSP18.1重組載體

采用酶切連接法構(gòu)建重組載體。酶切回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)對(duì)應(yīng)酶切的pET-28a表達(dá)載體，16℃過(guò)夜進(jìn)行連接，獲得pET-28a-CssHSP18重組質(zhì)粒，并采用雙酶切以及測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，該載體中含有His標(biāo)簽。

1.5 生物信息學(xué)分析

以CssHSP18.1蛋白序列搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其他同源蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件，以鄰接法（Neighbor-joining，NJ；bootstrap=1?000）構(gòu)建無(wú)根進(jìn)化樹(shù)；通過(guò)EXPASy（https://web.expasy.org）的Prot-Paramtool及ProtScale在線程序預(yù)測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量和氨基酸疏水性；采用HMMER-3.2.1及SMART（http://smart.embl- heidelberg.de）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；采用TMHMM軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)[28]；蛋白亞細(xì)胞定位通過(guò)ProtComp 9.0（http://linux1.softberry.com）預(yù)測(cè)；利用PFP（http://dragon.bio.purdue.edu/pfp）對(duì)基因編碼產(chǎn)物功能進(jìn)行分析。

表1 引物序列

注：下劃線部分為酶切位點(diǎn)；CsPTB：多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白

Note: The underlined part is the enzyme cutting site. CsPTB: Polypyrimidine tract-binding protein

1.6 CssHSP18.1基因表達(dá)分析

選取長(zhǎng)勢(shì)一致茶苗，分別噴施PEG 6000（20%）、甘露醇（-mannitol，300?mmol·L-1）、吲哚乙酸（IAA，10?μmol·L-1）和-氨基丁酸（GABA，1?mmol·L-1）進(jìn)行脅迫處理，分別在處理0、0.5、1、3、6、9、12?h和24?h取樣，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品用液氮速凍后置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 CssHSP18.1蛋白可溶性表達(dá)

將測(cè)序成功的pET-28a-CssHSP18.1重組表達(dá)載體，利用熱激法分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞JM109（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLys、Tuner（DE3），37℃過(guò)夜培養(yǎng)活化菌株；分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0?mmol·L-1和1.2?mmol·L-1IPTG；并分別在16℃、20℃、25℃、30℃和37℃下誘導(dǎo)表達(dá)5~16?h，誘導(dǎo)獲得CssHSP18.1重組蛋白，誘導(dǎo)完成后，以轉(zhuǎn)速12?000?r·min-1離心2?min，收集菌液，用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）懸浮后，經(jīng)超聲破碎儀破碎2?min，離心5?min，在沉淀和上清液中分別加入上樣緩沖液（Loading buffer），沸水變性5?min，取上清液進(jìn)行蛋白電泳，測(cè)試最佳表達(dá)菌株、最佳誘導(dǎo)溫度及最佳IPTG濃度。

1.8 蛋白免疫印跡分析

取表達(dá)的重組表達(dá)蛋白和對(duì)照組蛋白各10?μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用300?mA，65?min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后置PVDF膜于脫脂牛奶中封閉2?h，依次孵育一抗（Anti His抗體）和二抗（羊抗小鼠），最后向PVDF膜加入HRP化學(xué)發(fā)光底物液，于發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CssHSP18.1基因的克隆

以茶樹(shù)cDNA為模板，用CssHSP18.1-F/CssHSP18.1-R引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到480?bp大小的目的基因（圖1）。

注：M：marker，1和2：CssHSP18.1

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 CssHSP18.1蛋白的理化性質(zhì)與序列分析

由Prot-param對(duì)CssHSP18.1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為18.2?kDa，等電點(diǎn)為5.68，氨基酸總數(shù)159個(gè)，其中谷氨酸（Glu）含量最多，達(dá)到13.8%，不含半胱氨酸（Cys）和酪氨酸（Tyr）。負(fù)電荷殘基29個(gè)，正電荷殘基25個(gè)，脂溶指數(shù)為71.70，不穩(wěn)定指數(shù)為62.21，具較強(qiáng)親水性（表2）。

利用DNAMAN對(duì)已注釋的茶樹(shù)HSP20蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，CssHSP18.1與CssHSP17.7相似度高達(dá)75.53%，其次為CssHSP17.5、CssHSP15和CssHSP21.8，相似度均低于60%（圖2-A）。對(duì)不同物種間HSP20進(jìn)行序列比對(duì)以及同源性分析，結(jié)果表明，不同物種間的HSP20蛋白氨基酸序列都存在1個(gè)保守的HSP20結(jié)構(gòu)域，與櫟（）QssHSP18.1和蘋果（）MdsHSP18.1相似度最高，達(dá)81.25%；與西瓜（）ClsHSP18.1、獼猴桃（）AcsHSP18.1等相似度達(dá)到70%以上（圖2-B，圖3），說(shuō)明HSP18.1在植物中保守性較高。

2.2.2 CssHSP18.1蛋白功能及親水性分析

采用PFP預(yù)測(cè)CssHSP18.1蛋白功能（表3，僅列出評(píng)分高于1?300的預(yù)測(cè)結(jié)果），結(jié)果表明其可能參與植物應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)?；赑rotScale對(duì)CssHSP18.1蛋白親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其親水性上下限分別為1.622和–3.667，親水范圍較大，與Prot-param預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，該蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)親水性。

表2 CssHSP18.1蛋白的基本理化性質(zhì)

注：A：CsHSP18.1蛋白與茶樹(shù)其他HSP20蛋白比對(duì)分析；B：CsHSP18.1蛋白與其他植物同源蛋白比對(duì)分析。紫框內(nèi)為HSP20結(jié)構(gòu)域；Cs：茶樹(shù)；Qs：櫟；Md：蘋果；Py：日本櫻花；Pa：甜櫻桃；Cl：西瓜；Ac：獼猴桃

注：Pa：甜櫻桃；Py：日本櫻花；Md：蘋果；Qs：櫟；Cs：茶樹(shù)；Ac：獼猴桃；Tc：可可豆；Dz：榴蓮；Pe：胡楊；Pt：毛果楊；Cf：土瓶草；Cl：西瓜；Cm：甜瓜；Mc：苦瓜

表3 CssHSP18.1基因編碼蛋白功能預(yù)測(cè)

2.2.3 CssHSP18.1蛋白亞細(xì)胞定位與跨膜結(jié)構(gòu)分析

用ProtComp 9.0軟件對(duì)CssHSP18.1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)（表4），說(shuō)明其編碼的蛋白可能在植物細(xì)胞核外發(fā)揮作用。TMHMM分析表明，CssHSP18.1蛋白無(wú)跨膜區(qū)。

2.3 CssHSP18.1基因表達(dá)分析

為研究基因?qū)γ{迫的響應(yīng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析茶樹(shù)經(jīng)-甘露醇（-Mannitol）、-氨基丁酸（GABA）、吲哚乙酸（IAA）以及聚乙二醇（PEG 6000）處理后的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)基因的相對(duì)表達(dá)量隨處理時(shí)間不同而發(fā)生變化（圖4）。結(jié)果顯示，在-Mannitol處理后，的表達(dá)受到抑制，在0.5?h時(shí)表達(dá)量較低，隨后逐漸上調(diào)，9?h時(shí)表達(dá)量再次下調(diào)（圖4-A）；經(jīng)GABA處理在1?h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，是對(duì)照組的3.1倍，隨后逐漸下調(diào)，但均高于對(duì)照，說(shuō)明GABA對(duì)該基因具有誘導(dǎo)作用（圖4-B）；經(jīng)IAA處理，基因表達(dá)呈先升后降趨勢(shì)，在0.5?h時(shí)表達(dá)量最高，6?h時(shí)表達(dá)量較低（圖4-C）；PEG 6000處理，基因表達(dá)量在0.5?h即達(dá)到峰值，之后下降，在3?h時(shí)再次上調(diào)，之后維持在相同水平（圖4-D）。

表4 CssHSP18.1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

注：A：D-甘露醇處理；B：γ-氨基丁酸處理；C：吲哚乙酸處理；D：PEG 6000處理；內(nèi)參基因：CsPTB；a，b，c表示各個(gè)處理之間方差分析差異顯著性（P＜0.05）

2.4 CssHSP18.1蛋白原核表達(dá)分析

2.4.1 構(gòu)建pET-28a-CssHSP18.1原核表達(dá)載體

PCR擴(kuò)增的片段與載體pET-28a分別經(jīng)和雙酶切，DNA連接酶連接構(gòu)建重組載體。構(gòu)建好的重組載體經(jīng)過(guò)/雙酶切處理后，可得到1條約1.4?kb的條帶，表明基因與pET-28a載體連接成功（圖5）。

2.4.2 CssHSP18.1蛋白表達(dá)最佳菌株的篩選

將2.4.1章節(jié)所獲的重組載體分別轉(zhuǎn)化到JM109（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLys、Tuner（DE3）等菌株，獲得對(duì)應(yīng)重組表達(dá)菌株。用15% SDS-PAGE檢測(cè)CssHSP18.1蛋白可溶性表達(dá)。結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白在JM109（DE3）和Tuner（DE3）菌株中不表達(dá)（圖6，泳道1，2），而在BL21（DE3）和BL21（DE3）PLys重組菌株的上清液中均有1條大約20?kDa的條帶（圖6，泳道3，4），且在BL21（DE3）菌株中的條帶亮度比BL21（DE3）PLys高，表明CssHSP18.1蛋白的最佳原核可溶性表達(dá)菌株為BL21（DE3）。

2.4.3 CssHSP18.1最佳誘導(dǎo)溫度的篩選

取2.4.2章節(jié)中篩選所得最佳表達(dá)菌株BL21（DE3），分別在16℃、20℃、25℃、30℃和37℃溫度下進(jìn)行CssHSP18.1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，用1?mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)結(jié)果用15% SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白在這些溫度誘導(dǎo)下均能表達(dá)，且出現(xiàn)明顯單一的目的蛋白條帶（圖7）。隨著溫度的逐漸升高，CssHSP18.1蛋白表達(dá)逐漸增加，在30℃時(shí)，蛋白條帶最亮，表達(dá)最佳。因此，選擇30℃用于后續(xù)試驗(yàn)（圖7，泳道2）。

注：泳道1：質(zhì)粒DNA；泳道2：經(jīng)Mlu I和Xho I消化后的重組表達(dá)質(zhì)粒；泳道M：DNA marker

注：M：蛋白marker；1—4分別為JM109（DE3）、Tuner（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）PLys菌株裂解上清液

2.4.4 CssHSP18.1最佳誘導(dǎo)IPTG濃度的篩選

取BL21（DE3）重組菌株，更改誘導(dǎo)IPTG濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?mmol·L-1，經(jīng)30℃誘導(dǎo)表達(dá)8?h后，用15% SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。從圖8可知，隨著IPTG濃度的升高，CssHSP18.1蛋白表達(dá)量逐漸增加，其中在IPTG濃度為1.2?mmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高（圖8，泳道6），說(shuō)明此濃度為最佳誘導(dǎo)濃度。

2.4.5 CssHSP18.1蛋白Western blot檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)的重組蛋白是否為CssHSP18.1，使用Anti His抗體對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫印跡（Western blot）檢測(cè)。結(jié)果顯示，BL21（DE3）重組菌株在30℃、1.2?mmol?L-1IPTG誘導(dǎo)下，在細(xì)胞裂解液的上清液和沉淀中均能檢測(cè)到CssHSP18.1蛋白（圖9，泳道5—6）。當(dāng)不加IPTG誘導(dǎo)劑時(shí)，只在細(xì)胞裂解液的沉淀中檢測(cè)到CssHSP18.1（圖9，泳道4），在其上清液中未檢測(cè)到CssHSP18.1（圖9，泳道3）。陰性對(duì)照pET-28a中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)條帶（圖9，泳道1—2）。

3 討論

研究報(bào)道，HSP蛋白在植物中起著響應(yīng)逆境脅迫的作用，并作為分子伴侶輔助其他蛋白正確合成與加工，同時(shí)對(duì)生物體正常機(jī)能的維護(hù)有重大意義[30]。HSP家族龐大且功能多樣，幾乎分布于所有生物體，近年來(lái)對(duì)HSP70家族的研究已成為熱點(diǎn)[31]。

注：M：蛋白marker；1—5分別為CssHSP18.1在37℃、30℃、25℃、20℃、16℃誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清液

注：M：蛋白marker；1—6分別為CssHSP18.1在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0?mmol·L-1和1.2?mol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清液

注：M：蛋白mark；1：空載體誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清液；2：空載體誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞沉淀；3：0?mol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清液；4：0?mol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞沉淀；5：1.2?mol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清液；6：1.2?mol·L-1 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞沉淀

基因作為一類小家族成員，在植物處于非生物脅迫時(shí)，小分子熱激蛋白表達(dá)會(huì)上調(diào)，以增強(qiáng)植物的抗逆性。例如，基因的表達(dá)提高了擬南芥種子萌發(fā)活力[32]；月季基因可減輕高鹽或旱害條件對(duì)煙草的影響[33]；Pla等[34]報(bào)道基因能夠增強(qiáng)櫟的抗氧化作用；小麥處于高鹽或干旱危害下sHSPs蛋白表達(dá)量會(huì)上調(diào)10倍以上[35]；小麥能夠調(diào)控種子成熟與萌發(fā)，并有助于提高其耐熱性[36]。在生物脅迫方面，基因參與白葉枯病病原與水稻的互作[37]，對(duì)植物病原侵染過(guò)程有識(shí)別和輔助的作用[38]；小麥sHSP23.6蛋白可與小麥黃化花葉病毒CP蛋白互作[39]。

目前對(duì)茶樹(shù)的研究主要集中在對(duì)非生物脅迫的抗性作用方面。王明樂(lè)等[40]發(fā)現(xiàn)基因與茶樹(shù)抗熱、高鹽及外源脫落酸有關(guān)；陳江飛等[27]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)小分子熱激蛋白CsHSP17.5在熱脅迫下明顯增加；在擬南芥異源表達(dá)茶樹(shù)3個(gè)基因可明顯提高其耐熱性[27]。據(jù)報(bào)道，茶樹(shù)基因經(jīng)過(guò)PEG 6000干旱處理后，在0.5?h時(shí)表達(dá)量最高，與本研究的基因表達(dá)結(jié)果相似[41]；在干旱處理下，茶樹(shù)、、和基因與本研究的基因的表達(dá)量均呈先升后降的趨勢(shì)[27]；側(cè)柏和基因參與其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)和修復(fù)[42]。因此，推測(cè)基因也可能參與了茶樹(shù)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)和修復(fù)。

蛋白表達(dá)研究通常采用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，而大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)作為外源蛋白表達(dá)的主要工具，具有表達(dá)量大、背景低、繁殖快等特點(diǎn)[43-44]，但是在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，細(xì)菌表達(dá)菌株、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度均能對(duì)表達(dá)結(jié)果產(chǎn)生影響[45]。為獲得CssHSP18.1蛋白的最佳表達(dá)條件，本研究對(duì)CssHSP18.1蛋白的可溶性表達(dá)條件進(jìn)行研究，最終獲得相對(duì)分子質(zhì)量約為20?kDa的可溶性蛋白，這與理論值18.25?kDa非常接近。前人對(duì)麻瘋樹(shù)、蠟梅及巴西橡膠樹(shù)等進(jìn)行sHSPs蛋白的原核表達(dá)探索[46-48]，重組表達(dá)菌株均為BL21（DE3），這與本研究茶樹(shù)基因的最佳表達(dá)菌株相同。

本研究從福鼎大白茶中克隆1個(gè)基因的ORF，并對(duì)其進(jìn)行基本理化性質(zhì)、親緣關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析。RT-qPCR分析表明，基因表達(dá)受到GABA、IAA以及PEG 6000誘導(dǎo)，而D-Mannitol則抑制基因表達(dá)。CssHSP18.1蛋白在BL21（DE3）菌株、30℃和1.2?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)濃度下蛋白可溶性表達(dá)最佳。本研究結(jié)果將對(duì)基因生物學(xué)功能及結(jié)構(gòu)解析提供參考。但基因在真核的表達(dá)及蛋白互作等方面仍需進(jìn)一步研究。

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Cloning and Expression Analysis ofGene in

JIANG Junmei1, FANG Yuanpeng1, NING Na1, CHEN Meiqing1, YANG Zaifu1, WANG Yong1, LI Xiangyang2*, XIE Xin1*

1. Agricultural College of Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Research and Development Center for Fine Chemicals, Guizhou University, Guiyang 550025, China

Thegene family encodes a class of small molecular heat shock proteins, which are widely distributed in plants, functioned as molecular chaperones, and play an important role in plant resistance to stresses. In this study, the open reading frame (ORF) ofgene cDNA was obtained by gene cloning, which is 480?bp in length and encodes 159 amino acids. Bioinformatics analysis showed that CssHSP18.1 protein contained a typical HSP20 domain. Its molecular weight and isoelectric point are about 18.25?kDa and 5.68 respectively. Phylogenetic tree analysis showed that CssHSP18.1 has the closest relationship with quercus and apple. It was predicted that CssHSP18.1 protein was does not have signal peptide and transmembrane structure. RT-qPCR analysis showed that the expression ofunder D-Mannitol treatment was lower than that in the control group. GABA could enhance the expression ofwith its peak at 1?h after GABA treatment. The expression ofwas upregulated upon IAA and PEG 6000 treatments, and reached the peaks at 0.5?h. Thus, GABA、IAA、PEG 6000 could induce the expression of. To obtain CssHSP18.1 soluble protein, a recombinant plasmid pET-28a-CssHSP18.1 was constructed and expressed in prokaryotic system. The expression strains, induction temperatures and induction concentrations of IPTG (isopropyl---thiopyranogalactoside) were optimized. The results showed that the best expression strain of CssHSP18.1 protein was BL21 (DE3), and the best induction temperature and IPTG concentration were 30℃and 1.2?mmol·L-1respectively. Finally, western blot was used to verify the expression of CssHSP18.1 protein. This study provided a basis for further study on the biological function ofgene.

,, gene cloning, bioinformatics analysis, stress, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)03-328-13

2019-08-30

2020-01-07

貴州省高層次留學(xué)人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（[2018]02號(hào)）、貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2019]2408號(hào)）、貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才[2018]5781號(hào)）

蔣君梅，女，主要從事茶樹(shù)抗病基因功能方面的研究，jjmguangan@163.com。*通信作者：xyli1@gzu.edu.cn；xiexin2097757@163.com

投稿平臺(tái)：http://cykk.cbpt.cnki.net