蔣君梅，方遠鵬，寧娜，陳美晴，楊再福，王勇，李向陽，謝鑫*

茶樹基因克隆及表達分析

蔣君梅1，方遠鵬1，寧娜1，陳美晴1，楊再福1，王勇1，李向陽2*，謝鑫1*

1. 貴州大學農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國家重點實驗室培育基地 教育部重點實驗室 精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025

基因家族可編碼一類小分子的熱激蛋白，廣泛分布于植物中，具有分子伴侶的功能，在植物抵抗逆境脅迫中起著重要作用。通過基因克隆的方法，獲得1個茶樹基因的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），其全長480?bp，編碼159個氨基酸。生物信息學分析表明，CssHSP18.1蛋白含有1個典型HSP20結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量約為18.25?kDa，等電點為5.68，偏酸性，與櫟和蘋果親緣關系最近，無信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)。RT-qPCR分析表明，在甘露醇（-Mannitol）處理下表達量低于對照組；-氨基丁酸（GABA）能促進該基因的表達，在處理后1?h時表達量達到峰值；吲哚乙酸（IAA）和聚乙二醇（PEG 6000）處理后，在0.5?h時表達量最高，即GABA、IAA、PEG 6000均可誘導的表達。為獲得CssHSP18.1可溶性蛋白，構(gòu)建了pET-28a-CssHSP18.1重組質(zhì)粒進行原核表達，并分別對表達菌株、誘導溫度以及IPTG（異丙基---硫代吡喃半乳糖苷）誘導濃度進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白最佳表達菌株為BL21（DE3），最佳誘導溫度和IPTG濃度分別為30℃和1.2?mmol·L-1。最后，采用Western blot對表達的CssHSP18.1蛋白進行驗證。本研究為進一步揭示基因的生物學功能提供依據(jù)。

茶樹；；基因克??；生物信息學分析；脅迫；表達分析

茶樹（）是一種重要的經(jīng)濟作物[1]，在種植過程中易受高溫、低溫和干旱等脅迫，從而影響茶樹生長、茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。因此，對茶樹進行抗性機制及抗性基因的研究具有重要意義。

分子伴侶（Molecular chaperones）是一類在細胞質(zhì)中能識別并結(jié)合不完整折疊或裝配的蛋白質(zhì)，能夠幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊、轉(zhuǎn)運，但其本身不參與最終產(chǎn)物的形成[3]。據(jù)報道，分子伴侶廣泛分布于動植物及微生物中，在其生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，包括維持發(fā)育穩(wěn)定[4]，調(diào)節(jié)植物抗病過程[5]，應對逆境脅迫（高溫[6]、高鹽[7]、干旱[8]等），以及病原耐熱性[9]等。熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是分子伴侶的一種，當有機體暴露在高溫下，機體為保護自身由熱激發(fā)合成的一類蛋白質(zhì)，現(xiàn)泛指因逆境誘導而產(chǎn)生的蛋白。一些HSPs蛋白具有分子伴侶功能，在植物受到脅迫時，可以維持細胞穩(wěn)態(tài)，在保護植物免受脅迫損害中起重要作用[10]。在正常狀態(tài)下HSPs含量僅占蛋白總量的5%，但當受到外界脅迫時，含量會迅速升高，可達到蛋白總量的15%[11-12]。根據(jù)蛋白質(zhì)大小分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSPs 5種類型[13]。

小分子熱激蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）是一類分子量為20?kDa左右的蛋白，故又被統(tǒng)稱為sHSP20[14]，sHSPs家族成員擁有1個約90個氨基酸組成的晶體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD結(jié)構(gòu)域，-crystallin domain，或稱HSP20結(jié)構(gòu)域）[15]。在細胞中，sHSPs蛋白起著對生物體在脅迫過程中產(chǎn)生的不穩(wěn)定蛋白進行“搶修”的作用[16]。植物sHSPs參與多種生理過程，包括抵御逆境[17-18]、預防不成熟蛋白聚集等[19]。目前在番茄（）[20]、甘蔗（）[21]、馬鈴薯（）[22]、核桃（）[23]、擬南芥（）[24]、西瓜（）[25]、百合（）[26]等植物中均有研究報道。在茶樹中已克隆了、、和等小分子熱激蛋白基因[27]，但對的研究鮮見報道。

本試驗克隆了1個茶樹基因，采用RT-qPCR對其表達模式進行分析，并通過原核表達方法進行蛋白表達，最后對蛋白可溶性表達條件進行探索，研究結(jié)果為CssHSP18.1蛋白生物學功能研究及晶體結(jié)構(gòu)解析提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茶樹品種為福鼎大白茶，為室內(nèi)盆栽，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：晝/夜溫度28℃/21℃，光周期12?h/12?h，相對濕度70%~80%，光照強度260?μmol·m-2·s-1。

1.2 供試試劑

Pfu高保真酶購自天根生化科技（北京）有限公司、限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳相關試劑均購自北京酷來博科技有限公司；感受態(tài)細胞JM109（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLys、Tuner（DE3）購自上海唯地生物技術有限公司；一抗Anti His和二抗（羊抗小鼠）均購自北京聚合美生物公司；RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；原核表達載體pET-28a為貴州大學植物病理教研室保存。

1.3 供試儀器

PCR擴增采用Bio-rad T-100梯度PCR儀（美國Bio-rad公司）；蛋白免疫印跡試驗采用天能5200化學發(fā)光檢測儀（上海天能科技有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳采用聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司]；ZWYR-D2402型號搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），細胞超聲波破碎儀（美國Sonics公司）。

1.4 茶樹CssHSP18.1基因克隆與重組載體構(gòu)建

1.4.1 總RNA的提取與cDNA的反轉(zhuǎn)錄

取茶樹葉片材料，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA，試驗步驟參照試劑盒說明書進行。

1.4.2基因ORF克隆

以cDNA為模板，使用引物CssHSP18.1-F/ CssHSP18.1-R（表1）對基因進行擴增。引物設計參考基因序列（KU963241.1），通過Primer Premier 5.0軟件設計。引物合成及擴增產(chǎn)物測序均委托北京擎科生物科技有限公司完成。

PCR擴增體系如下：Pfu 1?μL、cDNA1?μL、2.5?mmol·L-1dNTPs 4?μL、上下游引物各1?μL、5×buffer 10?μL、ddH2O 32?μL。PCR擴增條件為：95℃2?min；95℃20 s，58℃20 s，72℃30?s，32個循環(huán)。

1.4.3 構(gòu)建pET-28aCssHSP18.1重組載體

采用酶切連接法構(gòu)建重組載體。酶切回收后的擴增產(chǎn)物與經(jīng)對應酶切的pET-28a表達載體，16℃過夜進行連接，獲得pET-28a-CssHSP18重組質(zhì)粒，并采用雙酶切以及測序進一步驗證，該載體中含有His標簽。

1.5 生物信息學分析

以CssHSP18.1蛋白序列搜索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得其他同源蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件，以鄰接法（Neighbor-joining，NJ；bootstrap=1?000）構(gòu)建無根進化樹；通過EXPASy（https://web.expasy.org）的Prot-Paramtool及ProtScale在線程序預測該蛋白的等電點、相對分子質(zhì)量和氨基酸疏水性；采用HMMER-3.2.1及SMART（http://smart.embl- heidelberg.de）網(wǎng)站預測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；采用TMHMM軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)[28]；蛋白亞細胞定位通過ProtComp 9.0（http://linux1.softberry.com）預測；利用PFP（http://dragon.bio.purdue.edu/pfp）對基因編碼產(chǎn)物功能進行分析。

表1 引物序列

注：下劃線部分為酶切位點；CsPTB：多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白

Note: The underlined part is the enzyme cutting site. CsPTB: Polypyrimidine tract-binding protein

1.6 CssHSP18.1基因表達分析

選取長勢一致茶苗，分別噴施PEG 6000（20%）、甘露醇（-mannitol，300?mmol·L-1）、吲哚乙酸（IAA，10?μmol·L-1）和-氨基丁酸（GABA，1?mmol·L-1）進行脅迫處理，分別在處理0、0.5、1、3、6、9、12?h和24?h取樣，設置3個生物學重復，樣品用液氮速凍后置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 CssHSP18.1蛋白可溶性表達

將測序成功的pET-28a-CssHSP18.1重組表達載體，利用熱激法分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞JM109（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLys、Tuner（DE3），37℃過夜培養(yǎng)活化菌株；分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0?mmol·L-1和1.2?mmol·L-1IPTG；并分別在16℃、20℃、25℃、30℃和37℃下誘導表達5~16?h，誘導獲得CssHSP18.1重組蛋白，誘導完成后，以轉(zhuǎn)速12?000?r·min-1離心2?min，收集菌液，用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）懸浮后，經(jīng)超聲破碎儀破碎2?min，離心5?min，在沉淀和上清液中分別加入上樣緩沖液（Loading buffer），沸水變性5?min，取上清液進行蛋白電泳，測試最佳表達菌株、最佳誘導溫度及最佳IPTG濃度。

1.8 蛋白免疫印跡分析

取表達的重組表達蛋白和對照組蛋白各10?μL，進行SDS-PAGE電泳，采用300?mA，65?min進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后置PVDF膜于脫脂牛奶中封閉2?h，依次孵育一抗（Anti His抗體）和二抗（羊抗小鼠），最后向PVDF膜加入HRP化學發(fā)光底物液，于發(fā)光檢測儀檢測蛋白表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 CssHSP18.1基因的克隆

以茶樹cDNA為模板，用CssHSP18.1-F/CssHSP18.1-R引物進行擴增，得到480?bp大小的目的基因（圖1）。

注：M：marker，1和2：CssHSP18.1

2.2 生物信息學分析

2.2.1 CssHSP18.1蛋白的理化性質(zhì)與序列分析

由Prot-param對CssHSP18.1蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白相對分子質(zhì)量為18.2?kDa，等電點為5.68，氨基酸總數(shù)159個，其中谷氨酸（Glu）含量最多，達到13.8%，不含半胱氨酸（Cys）和酪氨酸（Tyr）。負電荷殘基29個，正電荷殘基25個，脂溶指數(shù)為71.70，不穩(wěn)定指數(shù)為62.21，具較強親水性（表2）。

利用DNAMAN對已注釋的茶樹HSP20蛋白進行序列比對，結(jié)果顯示，CssHSP18.1與CssHSP17.7相似度高達75.53%，其次為CssHSP17.5、CssHSP15和CssHSP21.8，相似度均低于60%（圖2-A）。對不同物種間HSP20進行序列比對以及同源性分析，結(jié)果表明，不同物種間的HSP20蛋白氨基酸序列都存在1個保守的HSP20結(jié)構(gòu)域，與櫟（）QssHSP18.1和蘋果（）MdsHSP18.1相似度最高，達81.25%；與西瓜（）ClsHSP18.1、獼猴桃（）AcsHSP18.1等相似度達到70%以上（圖2-B，圖3），說明HSP18.1在植物中保守性較高。

2.2.2 CssHSP18.1蛋白功能及親水性分析

采用PFP預測CssHSP18.1蛋白功能（表3，僅列出評分高于1?300的預測結(jié)果），結(jié)果表明其可能參與植物應對脅迫反應?；赑rotScale對CssHSP18.1蛋白親水性進行預測，結(jié)果顯示其親水性上下限分別為1.622和–3.667，親水范圍較大，與Prot-param預測的結(jié)果一致，該蛋白表現(xiàn)出較強親水性。

表2 CssHSP18.1蛋白的基本理化性質(zhì)

注：A：CsHSP18.1蛋白與茶樹其他HSP20蛋白比對分析；B：CsHSP18.1蛋白與其他植物同源蛋白比對分析。紫框內(nèi)為HSP20結(jié)構(gòu)域；Cs：茶樹；Qs：櫟；Md：蘋果；Py：日本櫻花；Pa：甜櫻桃；Cl：西瓜；Ac：獼猴桃

注：Pa：甜櫻桃；Py：日本櫻花；Md：蘋果；Qs：櫟；Cs：茶樹；Ac：獼猴桃；Tc：可可豆；Dz：榴蓮；Pe：胡楊；Pt：毛果楊；Cf：土瓶草；Cl：西瓜；Cm：甜瓜；Mc：苦瓜

表3 CssHSP18.1基因編碼蛋白功能預測

2.2.3 CssHSP18.1蛋白亞細胞定位與跨膜結(jié)構(gòu)分析

用ProtComp 9.0軟件對CssHSP18.1蛋白的亞細胞定位進行預測，結(jié)果表明，該蛋白主要定位于細胞質(zhì)（表4），說明其編碼的蛋白可能在植物細胞核外發(fā)揮作用。TMHMM分析表明，CssHSP18.1蛋白無跨膜區(qū)。

2.3 CssHSP18.1基因表達分析

為研究基因?qū)γ{迫的響應，利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析茶樹經(jīng)-甘露醇（-Mannitol）、-氨基丁酸（GABA）、吲哚乙酸（IAA）以及聚乙二醇（PEG 6000）處理后的表達模式，發(fā)現(xiàn)基因的相對表達量隨處理時間不同而發(fā)生變化（圖4）。結(jié)果顯示，在-Mannitol處理后，的表達受到抑制，在0.5?h時表達量較低，隨后逐漸上調(diào)，9?h時表達量再次下調(diào)（圖4-A）；經(jīng)GABA處理在1?h時，表達量達到峰值，是對照組的3.1倍，隨后逐漸下調(diào)，但均高于對照，說明GABA對該基因具有誘導作用（圖4-B）；經(jīng)IAA處理，基因表達呈先升后降趨勢，在0.5?h時表達量最高，6?h時表達量較低（圖4-C）；PEG 6000處理，基因表達量在0.5?h即達到峰值，之后下降，在3?h時再次上調(diào)，之后維持在相同水平（圖4-D）。

表4 CssHSP18.1蛋白亞細胞定位預測

注：A：D-甘露醇處理；B：γ-氨基丁酸處理；C：吲哚乙酸處理；D：PEG 6000處理；內(nèi)參基因：CsPTB；a，b，c表示各個處理之間方差分析差異顯著性（P＜0.05）

2.4 CssHSP18.1蛋白原核表達分析

2.4.1 構(gòu)建pET-28a-CssHSP18.1原核表達載體

PCR擴增的片段與載體pET-28a分別經(jīng)和雙酶切，DNA連接酶連接構(gòu)建重組載體。構(gòu)建好的重組載體經(jīng)過/雙酶切處理后，可得到1條約1.4?kb的條帶，表明基因與pET-28a載體連接成功（圖5）。

2.4.2 CssHSP18.1蛋白表達最佳菌株的篩選

將2.4.1章節(jié)所獲的重組載體分別轉(zhuǎn)化到JM109（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLys、Tuner（DE3）等菌株，獲得對應重組表達菌株。用15% SDS-PAGE檢測CssHSP18.1蛋白可溶性表達。結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白在JM109（DE3）和Tuner（DE3）菌株中不表達（圖6，泳道1，2），而在BL21（DE3）和BL21（DE3）PLys重組菌株的上清液中均有1條大約20?kDa的條帶（圖6，泳道3，4），且在BL21（DE3）菌株中的條帶亮度比BL21（DE3）PLys高，表明CssHSP18.1蛋白的最佳原核可溶性表達菌株為BL21（DE3）。

2.4.3 CssHSP18.1最佳誘導溫度的篩選

取2.4.2章節(jié)中篩選所得最佳表達菌株BL21（DE3），分別在16℃、20℃、25℃、30℃和37℃溫度下進行CssHSP18.1蛋白誘導表達試驗，用1?mmol·L-1IPTG進行誘導，表達結(jié)果用15% SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，CssHSP18.1蛋白在這些溫度誘導下均能表達，且出現(xiàn)明顯單一的目的蛋白條帶（圖7）。隨著溫度的逐漸升高，CssHSP18.1蛋白表達逐漸增加，在30℃時，蛋白條帶最亮，表達最佳。因此，選擇30℃用于后續(xù)試驗（圖7，泳道2）。

注：泳道1：質(zhì)粒DNA；泳道2：經(jīng)Mlu I和Xho I消化后的重組表達質(zhì)粒；泳道M：DNA marker

注：M：蛋白marker；1—4分別為JM109（DE3）、Tuner（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）PLys菌株裂解上清液

2.4.4 CssHSP18.1最佳誘導IPTG濃度的篩選

取BL21（DE3）重組菌株，更改誘導IPTG濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?mmol·L-1，經(jīng)30℃誘導表達8?h后，用15% SDS-PAGE檢測表達結(jié)果。從圖8可知，隨著IPTG濃度的升高，CssHSP18.1蛋白表達量逐漸增加，其中在IPTG濃度為1.2?mmol·L-1時表達量最高（圖8，泳道6），說明此濃度為最佳誘導濃度。

2.4.5 CssHSP18.1蛋白Western blot檢測

為進一步驗證表達的重組蛋白是否為CssHSP18.1，使用Anti His抗體對表達的蛋白進行免疫印跡（Western blot）檢測。結(jié)果顯示，BL21（DE3）重組菌株在30℃、1.2?mmol?L-1IPTG誘導下，在細胞裂解液的上清液和沉淀中均能檢測到CssHSP18.1蛋白（圖9，泳道5—6）。當不加IPTG誘導劑時，只在細胞裂解液的沉淀中檢測到CssHSP18.1（圖9，泳道4），在其上清液中未檢測到CssHSP18.1（圖9，泳道3）。陰性對照pET-28a中未發(fā)現(xiàn)表達條帶（圖9，泳道1—2）。

3 討論

研究報道，HSP蛋白在植物中起著響應逆境脅迫的作用，并作為分子伴侶輔助其他蛋白正確合成與加工，同時對生物體正常機能的維護有重大意義[30]。HSP家族龐大且功能多樣，幾乎分布于所有生物體，近年來對HSP70家族的研究已成為熱點[31]。

注：M：蛋白marker；1—5分別為CssHSP18.1在37℃、30℃、25℃、20℃、16℃誘導表達的細胞上清液

注：M：蛋白marker；1—6分別為CssHSP18.1在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0?mmol·L-1和1.2?mol·L-1 IPTG誘導表達的細胞上清液

注：M：蛋白mark；1：空載體誘導表達的細胞上清液；2：空載體誘導表達的細胞沉淀；3：0?mol·L-1 IPTG誘導表達的細胞上清液；4：0?mol·L-1 IPTG誘導表達的細胞沉淀；5：1.2?mol·L-1 IPTG誘導表達的細胞上清液；6：1.2?mol·L-1 IPTG誘導表達的細胞沉淀

基因作為一類小家族成員，在植物處于非生物脅迫時，小分子熱激蛋白表達會上調(diào)，以增強植物的抗逆性。例如，基因的表達提高了擬南芥種子萌發(fā)活力[32]；月季基因可減輕高鹽或旱害條件對煙草的影響[33]；Pla等[34]報道基因能夠增強櫟的抗氧化作用；小麥處于高鹽或干旱危害下sHSPs蛋白表達量會上調(diào)10倍以上[35]；小麥能夠調(diào)控種子成熟與萌發(fā)，并有助于提高其耐熱性[36]。在生物脅迫方面，基因參與白葉枯病病原與水稻的互作[37]，對植物病原侵染過程有識別和輔助的作用[38]；小麥sHSP23.6蛋白可與小麥黃化花葉病毒CP蛋白互作[39]。

目前對茶樹的研究主要集中在對非生物脅迫的抗性作用方面。王明樂等[40]發(fā)現(xiàn)基因與茶樹抗熱、高鹽及外源脫落酸有關；陳江飛等[27]發(fā)現(xiàn)茶樹小分子熱激蛋白CsHSP17.5在熱脅迫下明顯增加；在擬南芥異源表達茶樹3個基因可明顯提高其耐熱性[27]。據(jù)報道，茶樹基因經(jīng)過PEG 6000干旱處理后，在0.5?h時表達量最高，與本研究的基因表達結(jié)果相似[41]；在干旱處理下，茶樹、、和基因與本研究的基因的表達量均呈先升后降的趨勢[27]；側(cè)柏和基因參與其對干旱脅迫的響應和修復[42]。因此，推測基因也可能參與了茶樹對干旱脅迫的響應和修復。

蛋白表達研究通常采用原核和真核表達系統(tǒng)，而大腸桿菌原核表達系統(tǒng)作為外源蛋白表達的主要工具，具有表達量大、背景低、繁殖快等特點[43-44]，但是在蛋白誘導表達過程中，細菌表達菌株、誘導溫度和誘導劑IPTG濃度均能對表達結(jié)果產(chǎn)生影響[45]。為獲得CssHSP18.1蛋白的最佳表達條件，本研究對CssHSP18.1蛋白的可溶性表達條件進行研究，最終獲得相對分子質(zhì)量約為20?kDa的可溶性蛋白，這與理論值18.25?kDa非常接近。前人對麻瘋樹、蠟梅及巴西橡膠樹等進行sHSPs蛋白的原核表達探索[46-48]，重組表達菌株均為BL21（DE3），這與本研究茶樹基因的最佳表達菌株相同。

本研究從福鼎大白茶中克隆1個基因的ORF，并對其進行基本理化性質(zhì)、親緣關系、保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位等生物信息學分析。RT-qPCR分析表明，基因表達受到GABA、IAA以及PEG 6000誘導，而D-Mannitol則抑制基因表達。CssHSP18.1蛋白在BL21（DE3）菌株、30℃和1.2?mmol·L-1IPTG誘導濃度下蛋白可溶性表達最佳。本研究結(jié)果將對基因生物學功能及結(jié)構(gòu)解析提供參考。但基因在真核的表達及蛋白互作等方面仍需進一步研究。

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Cloning and Expression Analysis ofGene in

JIANG Junmei1, FANG Yuanpeng1, NING Na1, CHEN Meiqing1, YANG Zaifu1, WANG Yong1, LI Xiangyang2*, XIE Xin1*

1. Agricultural College of Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Research and Development Center for Fine Chemicals, Guizhou University, Guiyang 550025, China

Thegene family encodes a class of small molecular heat shock proteins, which are widely distributed in plants, functioned as molecular chaperones, and play an important role in plant resistance to stresses. In this study, the open reading frame (ORF) ofgene cDNA was obtained by gene cloning, which is 480?bp in length and encodes 159 amino acids. Bioinformatics analysis showed that CssHSP18.1 protein contained a typical HSP20 domain. Its molecular weight and isoelectric point are about 18.25?kDa and 5.68 respectively. Phylogenetic tree analysis showed that CssHSP18.1 has the closest relationship with quercus and apple. It was predicted that CssHSP18.1 protein was does not have signal peptide and transmembrane structure. RT-qPCR analysis showed that the expression ofunder D-Mannitol treatment was lower than that in the control group. GABA could enhance the expression ofwith its peak at 1?h after GABA treatment. The expression ofwas upregulated upon IAA and PEG 6000 treatments, and reached the peaks at 0.5?h. Thus, GABA、IAA、PEG 6000 could induce the expression of. To obtain CssHSP18.1 soluble protein, a recombinant plasmid pET-28a-CssHSP18.1 was constructed and expressed in prokaryotic system. The expression strains, induction temperatures and induction concentrations of IPTG (isopropyl---thiopyranogalactoside) were optimized. The results showed that the best expression strain of CssHSP18.1 protein was BL21 (DE3), and the best induction temperature and IPTG concentration were 30℃and 1.2?mmol·L-1respectively. Finally, western blot was used to verify the expression of CssHSP18.1 protein. This study provided a basis for further study on the biological function ofgene.

,, gene cloning, bioinformatics analysis, stress, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)03-328-13

2019-08-30

2020-01-07

貴州省高層次留學人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)擇優(yōu)資助項目（[2018]02號）、貴州省科技計劃項目（黔科合支撐[2019]2408號）、貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才[2018]5781號）

蔣君梅，女，主要從事茶樹抗病基因功能方面的研究，jjmguangan@163.com。*通信作者：xyli1@gzu.edu.cn；xiexin2097757@163.com

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