□ 馬永飛 劉鍇 張巍 灌云縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心

□ 謝觀雷（通信作者） 江蘇智盛環(huán)境科技有限公司

□ 劉朕 江蘇省水文水資源勘測(cè)局淮安分局

氯霉素又名氯胺苯醇，是一種廣譜抗菌素，可有效抑制革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌等多種病原菌[1]。由于氯霉素具有面世時(shí)間早、藥性穩(wěn)定、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，曾被廣泛應(yīng)用于畜禽疾病的控制與治療[2]。但是，食品中殘留的氯霉素會(huì)對(duì)人體健康造成威脅，如可逆性骨髓抑制、神經(jīng)系統(tǒng)受損等，故西方發(fā)達(dá)國(guó)家已將氯霉素列為違禁藥物[3]。我國(guó)現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告）中也明確規(guī)定，氯霉素在動(dòng)物源性食品中不得檢出[4]。甲砜霉素是氯霉素的同類(lèi)物[5]，其抗菌譜和抗菌作用與氯霉素相仿—具有廣譜抗微生物作用，可有效殺滅流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌[6]。作為氯霉素的替代品，甲砜霉素能有效克服氯霉素導(dǎo)致的再生障礙性貧血的副作用[7]，故被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品的生產(chǎn)以防治畜禽由流感桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)菌屬感染導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)、肝膽系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病[8]，但甲砜霉素殘留量過(guò)高也會(huì)對(duì)人體健康造成危害。因此，全球各國(guó)分別制定了甲砜霉素在肉類(lèi)食品中的最高殘留限量[9]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告中規(guī)定，食品中甲砜霉素的最大殘留限量為50μg/kg。

由于動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量超標(biāo)會(huì)影響肉、蛋、奶等食品的安全性，不僅會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，還不利于我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，更會(huì)對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的出口造成不利影響[10]。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、高效、安全的氯霉素類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)方法已迫在眉睫。本研究利用QuE-UPLC/MS/MS法測(cè)定草魚(yú)、豬肉、牛奶、蜂蜜等動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物的殘留量，希望能對(duì)相關(guān)檢測(cè)工作起到借鑒作用。

1 材料和方法

1.1 所需儀器設(shè)備和試劑樣品

1.1.1 儀器設(shè)備

Waters Xevo TQD三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，沃特世公司；ME204T分析天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；EPED-PLUS-E3超純水機(jī)，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；HD-2500多管漩渦混合儀，杭州佑寧儀器有限公司；MV5多通道平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.1.2 試劑樣品

市售草魚(yú)、豬肉、牛奶、蜂蜜等動(dòng)物源性食品；色譜純乙腈，氯霉素、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品，壇墨質(zhì)檢；ProElut QuE 2mL Tube固相萃取凈化管、0.22μm ProMax尼龍針頭式濾器，迪馬科技。

1.2 操作方法

1.2.1 提取

1.2.1.1 豬肉、草魚(yú)、蜂蜜樣品

依次在15mL離心管中加入5.0g待測(cè)樣品、2.0g NaCl，攪拌均勻后加入5.0mL乙腈，在多管漩渦混合儀中渦旋混勻1min。振蕩5min，8000rpm下離心3min，取1mL上清液待凈化。

1.2.1.2 牛奶樣品

在15mL離心管中加入5.0g待測(cè)樣品、2.0g NaCl，攪拌均勻后加入2.5mL乙腈，在多管漩渦混合儀中渦旋混勻1min。振蕩5min，8000rpm下離心3min，取1mL上清液待凈化。

1.2.2 凈化

將1mL提取液轉(zhuǎn)移到ProElut QuE 2mL Tube固相萃取凈化管，渦旋混合30s。10000rpm下離心1min，取上清液500μL于濃縮管中，加水100μL，渦旋混勻，室溫下氮吹至剩余約100μL溶液，加水定容至500μL，混勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，進(jìn)LC-MS/MS分析。

1.2.3色譜條件

1.2.3.1 UPLC條件

色 譜 柱 C18：100×2.1mm，1.8μm； 流 速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：35℃；流動(dòng)相A：10mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B：乙腈；實(shí)驗(yàn)梯度洗脫程序設(shè)置參數(shù)如表1。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓：-4500V；霧化器壓力：50psi；輔助氣氣壓：50psi；氣簾氣壓力：20psi；離子源溫度：500℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

查閱文獻(xiàn)可知，氯霉素類(lèi)藥物殘留的提取劑有乙腈、乙酸乙酯[11]、水[12]等，本實(shí)驗(yàn)比較了3種不同的提取溶劑對(duì)提取效果的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以乙腈作為提取溶劑時(shí)，提取效果優(yōu)于乙酸乙酯和水，故本實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究分別以10mmol/L乙酸銨-乙腈、水-甲醇[13]、水-乙腈[14]為流動(dòng)相，按照“1.2.3.1”中的梯度洗脫條件進(jìn)行檢測(cè)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以10mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)氯霉素、甲砜霉素的分離效果最好，色譜峰尖銳、對(duì)稱(chēng)，響應(yīng)靈敏度最高。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)組分在0.25～50μg/kg的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程y=0.0084x+0.0366，相關(guān)系數(shù)R2=0.9932。采用在空白豬肉樣品中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)GB/T 27415-2013[15]的規(guī)定計(jì)算得出本實(shí)驗(yàn)最低定量限在0.25μg/kg，檢測(cè)限為 0.1μg/kg。

2.4 精密度和回收率試驗(yàn)

分別向空白草魚(yú)、豬肉、牛奶、蜂蜜等樣品中添加2個(gè)濃度水平的氯霉素、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。氯霉素、甲砜霉素的回收率分別為85.8%～96.4%，87.3%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～1.3%。

表2 實(shí)驗(yàn)回收率測(cè)定結(jié)果表

3 結(jié)論

本文建立了一種動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定方法，即采用乙腈作為提取溶劑，樣品經(jīng)攪勻、渦旋、振蕩、離心、凈化處理，然后上機(jī)分析。本方法的優(yōu)點(diǎn)為，樣品前處理方法簡(jiǎn)易、省時(shí)，并且能夠同時(shí)檢測(cè)氯霉素和甲砜霉素兩種目標(biāo)組分，在節(jié)省檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)降低了基質(zhì)效應(yīng)；氯霉素和甲砜霉素的回收率均達(dá)到85%以上，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性；氯霉素和甲砜霉素的檢出限均為0.1μg/kg，優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20756-2006的檢測(cè)方法。