□ 張淑瓊 廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院

1 引言

核苷酸（Nucleotide）是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖，以及磷酸這3種物質(zhì)組成的化合物，又稱核甙酸，其對嬰幼兒免疫功能、腸道功能、睡眠、脂類代謝、體格生長等方面起著重要作用［1］。奶粉中補(bǔ)充外源性核苷酸有助于改善人體腸道菌群、維持腸道的形態(tài)學(xué)及功能、促進(jìn)生長發(fā)育、提高免疫力等，因此近年來一些國家陸續(xù)允許將核苷酸添加到嬰幼兒奶粉中［2］。我國于2005年開始正式允許將核苷酸作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰幼兒配方食品中，主要包括胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）等?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880-2012）規(guī)定，核苷酸作為嬰幼兒配方食品中的食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑時(shí)允許使用量為0.12g～0.58g/kg（以核苷酸總量計(jì)）。本實(shí)驗(yàn)使用陰離子交換高效液相色譜法對上述5種核苷酸進(jìn)行了同時(shí)測定，希望建立一種靈敏度高、干擾少、定量準(zhǔn)確的測定方法，進(jìn)而滿足相關(guān)部門對嬰幼兒奶粉中核苷酸檢測的要求。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀（e2695），美國Waters公司；S220型pH計(jì)，瑞士Mettler-Toledo公司；超純水純化系統(tǒng)，美國millipore公司。

試劑：胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國Stanford Chemicals公司；甲醇（色譜純），德國默克公司；冰乙酸、乙酸銨（分析純），國藥集團(tuán)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別稱取核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP和IMP各5mg，用超純水溶解轉(zhuǎn)移至同一個(gè)100mL容量瓶中，純水定容至刻度。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為：CMP、AMP、UMP各100μg/mL，GMP、IMP 各 50μg/mL。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 樣品前處理

稱取混合均勻的固體試樣約5g（精確至0.1mg）置于100mL錐形瓶中，加入20mL熱水（50～60℃）充分溶解試樣，冷卻至室溫。用10%（V/V）醋酸溶液調(diào)試樣溶液pH值至4.1后，將溶液移入50mL容量瓶中，定容，濾紙過濾，所得濾液用0.45μm微膜過濾備用。

2.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SAX（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相（梯度流脫）A：50mmol/L磷酸二氫鉀水溶液，流動(dòng)相B：甲醇；梯度：0～25min、40%～100%A，25.0～2 5.1 mi n、100%～40%A，25.1～30min、40%A。

3 結(jié)果與分析

3.1 液相色譜條件的選擇

核苷酸是一類極性較大的化合物，當(dāng)采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸測定》（GB 5413.40-2016）方法中的C18-T反相色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，很難達(dá)到較好的保留和分離，目標(biāo)化合物的檢測也存在雜峰干擾，影響定量。標(biāo)準(zhǔn)方法采用的流動(dòng)相含有離子對試劑，長期使用不僅對色譜柱的損害較大，還會(huì)影響色譜柱的使用壽命。本實(shí)驗(yàn)通過將試樣溶液的pH值調(diào)節(jié)為弱酸性，適當(dāng)增加了溶液中的氫離子活度，促進(jìn)了核苷酸的電離反應(yīng)，使其在水溶液中呈離子狀態(tài)，從而適用于離子交換分離模式，更可用離子交換色譜柱進(jìn)行有效分離。

在流動(dòng)相的選擇上，本試驗(yàn)考察了不同pH值和不同濃度的磷酸二氫鉀溶液對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值越小、分離越差，原因應(yīng)為流動(dòng)相酸度過大時(shí)，氫離子抑制了核苷酸的電離和流動(dòng)相的電離，進(jìn)而降低了洗脫能力。當(dāng)流動(dòng)相pH值大于5時(shí)，核苷酸顯現(xiàn)多種電離形式，出現(xiàn)多于待測核苷酸種類的峰型，使分析變得困難。同時(shí)，流動(dòng)相的洗脫能力會(huì)隨流動(dòng)相濃度的增大而增強(qiáng)。因此，實(shí)驗(yàn)需根據(jù)色譜柱的實(shí)際使用情況，優(yōu)化流動(dòng)相濃度以達(dá)到合適的保留時(shí)間，并保證足夠的分離度。通過優(yōu)化，本試驗(yàn)選擇pH值為4.1的50mmol/L磷酸二氫鉀水溶液作為流動(dòng)相，通過梯度洗脫程序，在26min內(nèi)完成了對5種核苷酸的分離。實(shí)際樣品測定時(shí)，基質(zhì)出峰較早，不會(huì)對目標(biāo)物色譜峰產(chǎn)生干擾（色譜圖見圖1）。

圖1 同時(shí)測定5種核苷酸的高效液相色譜圖

3.2 方法的線性及檢出限

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合溶液2、4、6、8、10mL加純水定容至50mL，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，并以優(yōu)化的液相色譜條件進(jìn)入高效液相色譜進(jìn)行分析。以待測核苷酸的濃度為橫坐標(biāo)（X），待測核苷酸峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸分析，得到線性回歸方程及各待測核苷酸的線性相關(guān)系數(shù)。配制接近檢出限濃度的UMP、AMP、CMP、IMP、GMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算信噪比，以3倍信噪比計(jì)算檢出限（以稱樣5.0g、定容50mL計(jì)），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，5種核苷酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限為0.9～2.0mg/kg，可滿足檢測要求。

3.4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

以金領(lǐng)冠較大嬰兒配方奶粉（6～12月齡，2段）為本底，進(jìn)行低、中、高濃度加標(biāo)，按“2.2.1”樣品前處理方法處理樣品，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6次，計(jì)算3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果如表2所示，對奶粉樣品UMP、AMP、CMP、IMP、GMP的 回 收 率 在 78.2%～113.4%，RSD在0.3%～3.7%。結(jié)果表明，該方法具有良好的回收率和精密度，可以滿足對奶粉產(chǎn)品中上述5種核苷酸日常檢測的要求。

表1 5種核苷酸測定的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

表2 5種待測核苷酸在奶粉中的加標(biāo)回收率和精密度

4結(jié)論

本研究通過優(yōu)化高效液相色譜條件的參數(shù)，建立了一種基于離子交換原理的高效液相色譜法同時(shí)測定嬰幼兒奶粉中5種核苷酸的方法。該方法具有前處理簡單、干擾少、分析靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可滿足奶粉中核苷酸的檢測需求，能夠?yàn)槿橹破飞a(chǎn)企業(yè)核苷酸含量的質(zhì)量控制及食品安全抽樣檢測提供方法技術(shù)支持。