王 昀，秦堅源，賈生堯，王燕杰，吳 霞

中國計量大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，浙江 杭州 310018

引 言

農(nóng)藥是指以促成農(nóng)作物成長，保障農(nóng)作物健康為目標(biāo)而生產(chǎn)出的化合物。近年來農(nóng)藥中毒事件頻出，引發(fā)人們的持續(xù)關(guān)注。敵百蟲(Trichlorfon)，是一種適用于谷類作物上咀嚼式口器害蟲防治的有機(jī)磷農(nóng)藥，它能抑制膽堿酯酶，造成神經(jīng)生理功能紊亂，兼有觸殺作用和滲透活性[1]。若敵百蟲的過量使用，會造成農(nóng)藥的殘留污染，對人畜安全構(gòu)成一定威脅，影響人體的器官功能，甚至?xí)黾踊?、基因突變和DNA損傷的發(fā)病率，同時對哺乳動物的生殖及神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的毒副作用[2]。

為了保證土壤和食品的安全，現(xiàn)已開發(fā)出多種檢測各種基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的方法，其中以免疫法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的使用較為常見。Liu等[3]使用免疫法測定了果蔬中的敵百蟲和毒死蜱，敵百蟲的檢出限達(dá)到了19 μg·L-1，添加回收率為77.8%～92.0%。Sun等[4]使用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了6種常見的有機(jī)磷農(nóng)藥(敵百蟲、滅線磷、樂果、殺螟硫磷、對硫磷和倍硫磷)，該方法對敵百蟲的檢出限為0.12 μg·L-1，定量限為0.41 μg·L-1。這些方法需要復(fù)雜的預(yù)處理和專業(yè)人員的操作，耗時耗力的同時還會對實驗樣品造成損害。因此，急需探索一種簡單、快速及無損的農(nóng)藥殘留檢測方法用于敵百蟲殘留的檢測。

太赫茲波，在電磁波譜中處在微波和紅外線之間，其頻率范圍為0.1～10 THz，對應(yīng)的波長范圍是30～3 000 μm。太赫茲輻射的能量很低，不會引起待測物的有害電離反應(yīng)，從而為化學(xué)和生物樣品的無損檢測提供了可能[5]。此外，許多分子的轉(zhuǎn)動和振動模式都位于太赫茲波段，因此太赫茲光譜包含了豐富的分子結(jié)構(gòu)信息[6]。由于太赫茲波的獨(dú)特性質(zhì)，目前，太赫茲光譜已被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)診斷[7]、環(huán)境檢測[8]和食品分析[9]等多個領(lǐng)域。太赫茲時域光譜技術(shù)是太赫茲光譜中最常用的一種分析方法，已被應(yīng)用于葡萄糖[10]、鹽酸[11]、氨基酸[12]和抗生素[13]等方面的檢測。太赫茲頻域光譜是近兩年才發(fā)展起來的一種太赫茲光譜技術(shù)。相比太赫茲時域光譜技術(shù)，太赫茲頻域光譜具有能夠直接記錄樣品的透射信號、無需傅里葉變換和分辨率相對較高的優(yōu)點。因此，太赫茲頻域光譜在檢測領(lǐng)域更具應(yīng)用潛力。

本研究使用太赫茲頻域光譜檢測了土壤中的敵百蟲。首先采集敵百蟲純品在0.9～2.1 THz頻段的光譜，分析得到了它在該頻段的三個特征吸收峰(1.18，1.55和1.91 THz)。同時借助密度泛函理論計算敵百蟲分子的振動頻率，并與實驗結(jié)果進(jìn)行比對驗證，從而對敵百蟲特征吸收峰的來源進(jìn)行了解釋。采集了土壤中不同含量敵百蟲的太赫茲光譜，并利用化學(xué)計量學(xué)中的偏最小二乘算法建模，通過相關(guān)系數(shù)，校正均方根誤差、預(yù)測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差來評價模型的性能，證明了太赫茲頻域光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量法對土壤中敵百蟲含量檢測的可行性。

1 實驗部分

實驗所用敵百蟲樣品(99%，CAS：52-68-6)購置于廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司，土壤樣品取自青島嶗山。

敵百蟲純品壓片的制備：稱量一定量的敵百蟲樣品，轉(zhuǎn)移至研缽中充分研磨，然后稱取200 mg樣品，使用壓片機(jī)(HY-12，天津天光光學(xué)有限公司)在12 MPa的壓力下持續(xù)施壓兩分鐘使其成為厚度約1 mm直徑為13 mm的圓形薄片。

土壤純品壓片的制備：稱量一定量的土壤樣品，轉(zhuǎn)移至研缽中充分研磨后稱取200 mg樣品，使用壓片機(jī)在12 MPa的壓力下持續(xù)施壓兩分鐘使其成為厚度約1 mm直徑為13 mm的圓形薄片。

敵百蟲-土壤混合物壓片的制備：稱量一定量的敵百蟲樣品，轉(zhuǎn)移至研缽中充分研磨，備用；稱量一定量的土壤樣品，轉(zhuǎn)移至研缽中充分研磨，備用。分別稱量一定量的研磨后的敵百蟲樣品和土壤樣品，充分混合均勻，使得混合物的總質(zhì)量為200 mg，且其中敵百蟲的含量分別為0.5%，1%，5%，10%，20%，30%，40%和50%。將每一份的混合物樣品用壓片機(jī)在12 MPa的壓力下持續(xù)施壓兩分鐘使其成為厚度約1 mm直徑為13 mm的圓形薄片。為了減少操作誤差，每個含量的混合物樣品制備三個壓片。

采用太赫茲頻域光譜系統(tǒng)(TERASCAN 1550,TOPTICA Photonics Inc,Germany)來對樣品進(jìn)行光譜測量。該系統(tǒng)主要由DLC智能電子設(shè)備、光纖耦合銦鎵砷光混頻器和分布式反饋二極管激光器等組成。如圖1所示，太赫茲信號通過連續(xù)拍頻產(chǎn)生，從拋物面鏡準(zhǔn)直，再透過被測樣品被拋物面鏡聚焦到接收器上，然后轉(zhuǎn)移至信號處理系統(tǒng)加以處理即可得到樣品的相關(guān)光譜信息。選擇頻率范圍為0.86～2.26 THz，掃描步長為0.04 GHz。由于水對太赫茲光的強(qiáng)烈吸收，整個實驗過程在室溫狀態(tài)室內(nèi)濕度保持在4.0%以下。

圖1 太赫茲頻域光譜系統(tǒng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of THz-FDS system

樣品的吸收率α可由式(1)得到

α=-lgT

(1)

其中，T為透過率，可由樣品和參考的光電流振幅比較計算所得。

分子的太赫茲吸收峰來源于太赫茲波與分子中原子或官能團(tuán)的振動/旋轉(zhuǎn)之間的共振吸收[14]。基于密度泛函理論的理論計算，可以觀察每個吸收峰對應(yīng)的振動/轉(zhuǎn)動模式，從而對吸收峰進(jìn)行解釋。因此利用密度泛函理論的B3LYP/6-31G(d)基組對敵百蟲分子進(jìn)行了計算，以研究敵百蟲吸收峰的來源。

化學(xué)計量學(xué)是指利用運(yùn)用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)以及其他相關(guān)學(xué)科的理論和知識，來完成實驗設(shè)計與優(yōu)化和樣品的檢測與分析[15]。使用化學(xué)計量學(xué)中的偏最小二乘法算法(partial least squares,PLS)建立模型[16]，將所有樣品用于校正集和預(yù)測集，通過模型的相關(guān)系數(shù)，校正均方根誤差、預(yù)測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差來評判模型的性能。良好的模型應(yīng)該具有較為接近1的相關(guān)系數(shù)，較低的校正均方根誤差、預(yù)測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差。

2 結(jié)果與討論

采用Gaussian軟件對敵百蟲分子建立結(jié)構(gòu)如圖2所示。為了借助可視化窗口對敵百蟲分子進(jìn)行吸收峰的來源分析，我們先對敵百蟲分子中所有原子進(jìn)行標(biāo)號，其中，序號1，8，9和17為碳原子，序號5，7，13和15為氧原子，序號2，3，4，10，11，12，14和16為氫原子，序號18，19和20為氯原子，序號6為磷原子。

圖3(a)為通過理論計算得到的敵百蟲分子的振動模式(紅線)以及通過實驗測試得到的敵百蟲壓片的吸收光譜(黑線)。其中，紅線的高度代表了振動的強(qiáng)弱。圖3(a)可見，在理論計算中，敵百蟲分子有兩個振動模式，分別位于1.59和1.94 THz處，其中1.59 THz處的振動較強(qiáng)。而實驗測試得到敵百蟲存在三個特征吸收峰，分別位于1.18，1.55和1.91 THz處，其中1.18 THz處的特征峰的強(qiáng)度最大，吸光度達(dá)到約2.95；1.91 THz處特征峰的強(qiáng)度次之，吸光度為2.04；而1.55 THz處的特征峰的強(qiáng)度最弱，吸光度只有1.90。對比理論和實驗計算結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，理論計算得到的1.59 THz對應(yīng)于實驗測試得到的1.55 THz處的吸收峰；理論計算得到的1.94 THz對應(yīng)于實驗測試得到的1.91 THz處的吸收峰。通過Gaussian軟件可視化窗口觀察發(fā)現(xiàn)1.59 THz處的振動模式來源于9，10，11與12號原子組成的甲基的搖擺振動；而1.94 THz處的振動模式來源于17，18，19與20號原子的旋轉(zhuǎn)振動。值得注意的是，實驗得到的1.18 THz處的吸收峰在理論計算中沒有得到，分析認(rèn)為原因是理論計算的模型是單分子結(jié)構(gòu)，得到的振動模式是分子內(nèi)的作用力形成的；而實驗的對象是晶體結(jié)構(gòu)，得到的吸收峰除了分子內(nèi)作用力，還有分子間作用力的影響。因此，可以推測實驗中1.18 THz處的吸收峰是由分子間的相互作用力形成的。此外，在理論計算中1.94 THz處的振動較1.59 THz處的強(qiáng)一些，但是實驗中1.91 THz處的吸收峰稍弱于1.55 THz處的吸收峰，該現(xiàn)象也歸因于上述原因。由以上結(jié)果分析可知，敵百蟲在該頻段的三個特征吸收峰比較明顯的(1.18，1.55和1.91 THz)，可以作為對敵百蟲的定性檢測的依據(jù)。土壤純品壓片的吸收譜如圖3(b)所示。分析認(rèn)為，土壤在0.9～2.1 THz頻段沒有出現(xiàn)特征吸收峰。隨著頻率的增加，土壤的吸光度也逐漸增加，吸光度值的范圍在0.87～2.33。整條譜線呈現(xiàn)傾斜的背景，這是因為土壤顆粒對太赫茲散射的影響[17]。因為在1.0～1.5 THz頻段，敵百蟲是有特征吸收峰的，而土壤沒有表現(xiàn)處吸收峰，因此推測，在土壤基質(zhì)中鑒別敵百蟲是可以實現(xiàn)的。

圖2 敵百蟲分子結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Molecular structure of trichlorfon

圖3 敵百蟲純品(a)與土壤基質(zhì)(b)的吸收譜Fig.3 Absorption spectra of (a) trichlorfon and (b) soil

為了驗證太赫茲頻域光譜技術(shù)可以實現(xiàn)土壤中的敵百蟲殘留檢測的設(shè)想，采集了敵百蟲-土壤混合物壓片的吸收光譜。由于1.18 THz處的吸收峰相比其他兩個吸收峰較清晰而又易于辨認(rèn)，因此選擇該吸收峰附近的1～1.5 THz頻段對敵百蟲-土壤混合物壓片的吸收光譜進(jìn)行分析，如圖4所示。在1～1.5 THz范圍內(nèi)，所有光譜都有傾斜的背景基線，這是因為土壤的吸收導(dǎo)致的。在整個頻段內(nèi)，可以清楚區(qū)分?jǐn)嘲傧x含量大于或等于20%的壓片樣品，且隨著含量的增加，吸光度增加。在1.18 THz處，可以清楚區(qū)分?jǐn)嘲傧x含量大于或等于10%的壓片樣品，且隨著含量的增加，峰值處的吸光度增加。而敵百蟲含量低于或等于5%的壓片樣品的吸收光譜沒有出現(xiàn)1.18 THz處的特征吸收峰，吸光度值的變化也沒有規(guī)律。分析認(rèn)為在敵百蟲含量低的壓片中，土壤在混合樣品中占據(jù)主導(dǎo)地位，而由圖3可知土壤的吸光度高于敵百蟲的吸光度，從而土壤的光譜特性掩蓋了敵百蟲的吸收特性，因此無法鑒別土壤中敵百蟲含量低于或等于5%的壓片樣品。

圖4 不同濃度敵百蟲在土壤中的吸收光譜Fig.4 The absorption spectrum of different contents of trichlorfon in soil

研究中借助化學(xué)計量學(xué)方法來進(jìn)一步對土壤中敵百蟲含量進(jìn)行分析。由于實驗環(huán)境的微小變化和其他情況都可能對實驗結(jié)果造成影響，對全部實驗結(jié)果加以研究可能導(dǎo)致誤差或者增加額外的工作量，因此選取主成分分析方法來降低數(shù)據(jù)的維數(shù)?？紤]到敵百蟲的特征峰和高信噪比信號，選取1 174.44～1 193.24 THz頻段的光譜進(jìn)行偏最小二乘法建模，如圖4虛線框所示。該模型包含8個含量的24個壓片樣本。

圖5 偏最小二乘法模型對土壤中的敵百蟲含量的預(yù)測Fig.5 Content prediction of trichlorfon in soil by PLS model

其中17個樣本(8個濃度，0.5%，1%，5%，10%，20%，30%，40%和50%)作為校正集，剩余7個樣本(5個濃度，5%，10%，20%，30%和40%)作為預(yù)測集。模型分析結(jié)果如圖5所示。圖5(a)中，對角虛線表示為預(yù)測值和實際值差值為0，模型的預(yù)測集和校正集均靠近對角虛線，表現(xiàn)了預(yù)測集和校正集之間良好的線性關(guān)系。圖5(b)，虛線表示零誤差線，誤差度范圍為-0.04～0.04，模型的誤差較小。該模型具有相對較高的相關(guān)系數(shù)(>0.993 04)，較低的校正均方根誤差(<0.021 9)、預(yù)測均方根誤差(<0.024 6)和交叉驗證均方根誤差(<0.028 6)。

3 結(jié) 論

提出了一種基于太赫茲頻域光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)檢測土壤中敵百蟲含量的新方法。通過使用太赫茲頻域光譜技術(shù)得到了敵百蟲樣品的吸收峰分別為1.18，1.55和1.91 THz，其中吸光度最大的吸收峰在1.18 THz，在1.55 THz的吸收峰吸光強(qiáng)度最弱。將敵百蟲分子的理論計算的吸收峰與實驗吸收峰進(jìn)行了比對，對敵百蟲的吸收峰來源進(jìn)行了解釋，證實了實驗的準(zhǔn)確性。對不同含量的敵百蟲-土壤混合樣品光譜的研究發(fā)現(xiàn)，1.18 THz處的吸光度隨著敵百蟲的含量的增加而增大，對混合樣品使用偏最小二乘法建模，模型獲得了滿意的結(jié)果(R>0.993 04，RMSEC<0.021 9，RMSEP<0.024 6，RMSECV<0.028 6)。結(jié)果表明，該方法可以有效對土壤中的敵百蟲進(jìn)行定性和定量分析。證明了太赫茲頻域光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法在土壤的農(nóng)藥殘留檢測中極具應(yīng)用潛力，從而為環(huán)境檢測提供了一種新思路。