溫海燕，沈建云，姜 楠，周 萌，雷田田，邢 本，姜雙林*

（1.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.環(huán)境激素與生殖發(fā)育安徽省重點實驗室，安徽 阜陽 236037）

黑碳（black carbon,BC）是由生物質(zhì)或化石燃 料不完全燃燒產(chǎn)生的一種含碳的混合物，BC是大氣細顆粒物（fine particulate matter,PM2.5）的主要化學(xué)組分之一，構(gòu)成了PM2.5的碳核[1-2]。由于黑碳具有發(fā)達的孔隙、粒徑小、比表面積大等獨特的理化性質(zhì)，黑碳粒子在氣-粒傳輸轉(zhuǎn)化過程中，能極強的吸附多種有毒化學(xué)物質(zhì)（如重金屬離子、多環(huán)芳烴、無機鹽等），并經(jīng)過復(fù)雜的非均相光化學(xué)反應(yīng)形成二次黑碳粒子（內(nèi)混態(tài)黑碳顆粒），即黑碳-污染物復(fù)合體（black carbon-pollutant composites，BC-PCs）[3-4]。盡管大量的流行病學(xué)研究表明，PM2.5的短期和長期暴露能引發(fā)呼吸和心血管疾病以及過早死亡等一系列嚴重的健康問題[5-8]。但是，由于PM2.5的來源多樣以及復(fù)雜的化學(xué)組分，導(dǎo)致對PM2.5誘發(fā)的毒性和健康效應(yīng)的研究結(jié)論仍然存在著爭議[9]。近年來，PM2.5中含碳顆粒組分（如BC、元素碳和有機碳）誘發(fā)的健康風(fēng)險得到了流行病學(xué)證據(jù)的支持，如研究發(fā)現(xiàn)BC濃度與心血管疾病發(fā)生之間存在最強的相關(guān)性[1,3,6]。

毒理學(xué)研究也表明，來自不完全燃燒的BC顆粒在成纖維細胞系和巨噬細胞中比PM2.5的毒性更強，并呈現(xiàn)出明顯的劑量和尺寸依賴效應(yīng)[1,5]。體內(nèi)毒理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)BC等碳粒子能活化炎癥細胞，促進炎癥因子的釋放，誘發(fā)肺上皮細胞和泡巨噬細胞的凋亡，導(dǎo)致肺部炎癥的發(fā)生[10]。目前，BC粒子可能是進一步解析PM2.5誘發(fā)機體毒理效應(yīng)的關(guān)鍵組分之一，BC也被用于大氣毒理學(xué)和環(huán)境健康中PM2.5的替代物。

本研究以商業(yè)黑碳（C1864）為材料，通過測定黑碳誘發(fā)人肺泡上皮細胞（A549）的細胞活力，以及超氧化物歧化酶（intracellular superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化指標，探究黒碳誘發(fā)A549細胞毒性與氧化損傷效應(yīng)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進一步研究黒碳誘發(fā)的細胞毒性作用機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺泡上皮細胞系（A549）由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院梅一德教授饋贈，黑碳C1864購自上海昊化化工有限公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自博士德生物工程有限公司，D-MEM/F-12 培養(yǎng)基（Gibco，USA），PBS（BBI Life Science），10%標準胎牛血清(FetalBovine Serum，F(xiàn)BS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶-EDTA 消化液(Gibco，Rockville，MD，USA)；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、微量丙二醛（MDA）試劑盒和過氧化氫酶（CAT）測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)

A549細胞接種于含10%FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶（75 cm2）中，在37℃、5%CO2(v/v)飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)A549細胞融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。以1×105個/mL的細胞密度接種于96孔細胞板，4×105個/mL的細胞密度接種于6孔細胞板，用于后續(xù)的實驗指標的測定。

1.3 細胞染毒實驗

稱取黑碳C1864材料，將其溶解于無菌的重蒸水中，配制為1 mg·mL-1的BC貯備液，使用前超聲處理使BC粒子分散均勻，用D-MEM/F-12完全培養(yǎng)液將BC貯備液，稀釋成終濃度為5、10、20、40、80 μg·mL-1。待細胞培養(yǎng) 24 h 貼壁后，吸去上清液，用PBS洗滌，在96孔或6孔細胞板上分別加入不同濃度的BC染毒液，每個濃度設(shè)5個重復(fù)，設(shè)立陰性對照組（含有培養(yǎng)基加細胞，無BC染毒液）和空白對照組（僅有培養(yǎng)基）。

1.4 觀察指標的測定

1.4.1 細胞活力的測定

采用 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測定處理組和對照組細胞活力的變化，嚴格按照MTT檢測試劑盒的說明書進行操作。簡而言之，將1.0×105個/孔接種在96孔板中，處理組每孔加入不同濃度BC染毒溶液培養(yǎng)24 h，在490 nm處用酶標儀測量光密度值。

1.4.2 細胞氧化指標的測定

將4.0×105個/孔接種在6孔板中，處理組每孔加入不同濃度BC染毒溶液培養(yǎng)24 h后，從每個孔收集細胞培養(yǎng)液。嚴格按照SOD、LDH、MDA和CAT試劑盒的說明書進行操作，測定不同濃度BC處理后LDH、MDA、CAT和SOD的活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

單因素方差分析（ANOVA）對各處理組間的相關(guān)變量進行統(tǒng)計分析，每次實驗設(shè)3個復(fù)孔，每個實驗重復(fù)3次，所得數(shù)值采用均數(shù)±標準差表示。用GraphPad Prism軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，其中*p＜0.05、**p＜0.01 和***p＜0.001 表示與對照組相比差異的顯著性水平。

2.結(jié)果分析

2.1 黒碳對細胞活力的影響

為了評估BC粒子誘發(fā)A549細胞的毒性效應(yīng)，將細胞暴露于BC粒子24 h后觀察細胞形態(tài)和活力。隨著BC劑量的增加，在光學(xué)顯微鏡下觀察到細胞表面附著大量的BC粒子，細胞邊緣形狀不規(guī)則，細胞收縮崩解死亡，密度降低。我們進一步采用MTT法測定了細胞活力。由圖1可見，黑碳處理24 h后，細胞存活率顯著下降，細胞活力與劑量之間呈現(xiàn)較強的相關(guān)性

提示A549細胞對BC粒子呈現(xiàn)較高的敏感性，如在5 μg·mL-1低劑量處理組，細胞活力的下降與對照相比差異顯著（p＜0.05），在 80 μg·mL-1高劑量處理組，細胞活力的下降與對照相比達到極顯著水平（p＜0.001）。

圖1 黒碳對A549細胞活力的影響

2.2 黒碳對細胞膜的完整性影響

細胞膜是維持細胞內(nèi)環(huán)境的平衡的重要屏障，LDH是評價細胞膜完整性的重要指標。我們進一步測定了LDH的釋放量，以確證BC粒子對A549細胞的膜完整性影響。由圖2可見，不同劑量的BC粒子處理A549細胞24 h后，除了5 μg·mL-1處理外，其他劑量的處理LDH的釋放量均顯著的高于對照組，如80 μg·mL-1高劑量處理組LDH釋放量是對照組的2倍多；LDH的釋放量與BC劑量之間呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性

LDH測定數(shù)據(jù)進一步支持了MTT測定的細胞活力結(jié)果，提示BC粒子處理破壞了細胞膜的完整性，導(dǎo)致細胞活力下降。

圖2 黒碳對細胞膜的完整性影響

2.3 黒碳對細胞氧化損傷的效應(yīng)

2.3.1 黒碳對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD是細胞中主要的抗氧化酶之一，SOD酶的活性反映了細胞的酶抗氧化能力。由圖3可見，除了 5 μg·mL-1處理外，不同劑量的 BC 粒子處理A549細胞24 h后，SOD活性與對照相比顯著下降（p＜0.05），80 μg·mL-1高劑量處理組的SOD活性下降達到了顯著水平（p＜0.01）。在10～40 μg·mL-1劑量的處理組中，SOD活性下降并未呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，進一步分析SOD活性與劑量之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性

圖3 黒碳對超氧化物歧化酶活性的影響

2.3.2 黒碳對丙二醛（MDA）活性的影響

MDA是膜脂過氧化最重要產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，MDA是氧化脅迫最關(guān)鍵標志物。檢測MDA含量能進一步了解膜脂過氧化的程度。圖4表明，不同劑量的BC粒子處理A549細胞24 h后，在 20和 40μg·mL-1較高劑量的處理組MDA含量與對照相比達到顯著水平（p＜0.05）；尤其是 80 μg·mL-1高劑量處理組，MDA含量與對照組相比達到了極顯著水平（p＜0.001），而且與其它劑量的處理組進行比較MDA含量也達到了顯著水平（p＜0.05）。這些結(jié)果提示BC粒子僅在較高劑量下對A549細胞的膜脂過氧化產(chǎn)生損傷效應(yīng)，尤其以80 μg·mL-1處理最為明顯。

圖4 黒碳對丙二醛活性的影響

2.3.3 黒碳對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

過氧化氫酶（CAT）能夠促使過氧化氫（H2O2）分解為分子氧和水，清除細胞內(nèi)的H2O2，從而使細胞免于H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。由圖5結(jié)果可知，不同劑量的BC粒子處理A549細胞24 h后，CAT活力的下降與對照組相比均達到了顯著水平（p＜0.05）；但在 5～40 μg·mL-1濃度處理組中，CAT活力并未呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，僅在80 μg·mL-1劑量處理組CAT活性下降達到了顯著水平（p＜0.01），進一步分析表明CAT活性與劑量之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性

因此，不同濃度的BC粒子處理A549細胞后，導(dǎo)致了細胞內(nèi)CAT活力的顯著下降，表明BC粒子即使在低劑量下也能誘發(fā)A549細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，提示A549細胞對BC粒子毒性的高度敏感性。

圖5 黒碳對過氧化氫酶活性的影響

3 討論

人們越來越重視PM2.5的化學(xué)組分（如BC）對健康的不利影響[1,5,8]。盡管PM2.5中碳顆粒組分（如BC、元素碳和有機碳）誘發(fā)的毒性效應(yīng)和健康風(fēng)險（如誘發(fā)呼吸系統(tǒng)和心血管疾病），已經(jīng)得到了體內(nèi)外模型和流行病學(xué)證據(jù)的支持，但在不同的研究中對BC等細碳顆粒物誘發(fā)機體的毒性效應(yīng)的結(jié)論還存在著爭議[1]。這些差異可能歸因于BC的不同來源（如機動車或生物質(zhì)），尤其是BC吸附了許多污染物后更增加了黒碳毒性效應(yīng)的復(fù)雜性和不確定性[9-11]。盡管如此，由于黒碳粒子可控的形態(tài)和更簡單的組成，研究已經(jīng)證實BC是評價PM2.5健康效應(yīng)的重要測量指標[1,3,12]。因此，黒碳粒子模型有助于提高研究人員對不同來源的細顆粒成分（如機動車或生物質(zhì)）或黒碳吸附特定有毒成分的毒性理解和認識。

在本研究中，MTT數(shù)據(jù)顯示BC粒子能顯著的誘發(fā)A549細胞的毒性效應(yīng)，并呈現(xiàn)劑量-依賴效應(yīng)。值得注意的是即使在低劑量（5 μg·mL-1）的處理組，細胞活力的下降與對照相比也達到了顯著水平（p＜0.05）。這與我們先前的研究碳黒粒子誘發(fā)人A549毒性效應(yīng)基本一致，并觀察到細胞表面附著大量的BC粒子，細胞邊緣形狀不規(guī)則，細胞收縮崩解死亡，密度降低[12]。我們進一步使用透射電鏡檢查羧化黒碳粒子能夠被BEAS-2B細胞攝取，羧化BC粒子被內(nèi)化到細胞質(zhì)中，但羧化黒碳粒子沒有穿透細胞核，并且羧化黒碳能顯著誘發(fā)BEAS-2B細胞的毒性和炎癥反應(yīng)[13]。

LDH是反映細胞膜損傷的靈敏指標。事實上，細胞活力的下降這可歸因于A549細胞胞外乳酸脫氫酶（LDH）釋放和胞內(nèi)活性氧（ROS）生成水平的增加。前人的研究結(jié)果和我們先前的報道，已經(jīng)證明了PM2.5和黑碳粒子誘發(fā)產(chǎn)生的ROS能直接激活線粒體的通透性轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致線粒體膜電位（MMP）和線粒體膜完整性喪失，過量的ROS生成和還原劑消耗可導(dǎo)致組織損傷和細胞死亡[1,10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的BC處理A549細胞后，隨著BC濃度的升高LDH的釋放量顯著的增加，如高劑量（80 μg·mL-1）處理組的 LDH 釋放量是對照組的2倍多，LDH的釋放量呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。對LDH數(shù)據(jù)與MTT法測定的細胞活力數(shù)據(jù)的相關(guān)性進行分析表明，不同劑量BC處理組的LDH釋放量與細胞活力之間呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)（p＜0.01），提示BC粒子處理破壞了細胞膜的完整性，導(dǎo)致了細胞活力下降。

細胞的抗氧化防御系統(tǒng)包括抗氧化劑（如GSH）和抗氧化酶（如SOD、CAT），能夠防止產(chǎn)生過量的ROS形成后，ROS對各種細胞成分（如DNA、蛋白質(zhì)和脂類）的氧化損傷。事實上，許多研究已經(jīng)證實碳顆粒物（如黑碳、元素碳）誘發(fā)的氧化應(yīng)激或氧化損傷能夠?qū)е录毎允伞⒌蛲龌蛩劳鯷1,14-15]。在本研究中，不同劑量的BC處理A549細胞后，與對照相比超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性顯著下降，而丙二醛（MDA）的活性顯著上升，并且3種酶的活性呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。這些結(jié)果表明，BC誘導(dǎo)的A549細胞的氧化損傷是通過SOD、CAT和MDA活性的改變而實現(xiàn)的。

4 小結(jié)

黑碳粒子對A549細胞能產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，破壞細胞膜的完整性，細胞內(nèi)氧化酶和抗氧化酶體系失失衡，誘發(fā)細胞產(chǎn)生氧化損傷，最終導(dǎo)致細胞凋亡和死亡。值得注意的是測定BC粒子對A549細胞的氧化脅迫指標中，SOD和CAT的活力變化呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，但MDA含量的變化并未出現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。綜合分析這些研究結(jié)果提示，BC誘發(fā)的細胞膜完整性受損和氧化應(yīng)激可能在A549細胞毒性效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。關(guān)于BC誘發(fā)A549細胞毒性的分子作用機理有待進一步的研究。