祁智慧 張海洋 田 琳 王鵬杰 唐 芳 丁 軻

(北京農(nóng)學(xué)院1，北京 102206) (國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院2，北京 100037 )

我國稻谷的產(chǎn)量約占糧食總產(chǎn)量的三分之一[1]，作為主要糧食作物，稻谷的儲藏安全與人們的生活息息相關(guān)[1]。北方地區(qū)因其獨(dú)特的生態(tài)氣候條件，是我國優(yōu)質(zhì)粳稻的主產(chǎn)區(qū)和主要儲存區(qū)。稻谷儲藏時(shí)糧堆是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，而北方地區(qū)糧庫冬夏兩季的環(huán)境溫差極大，會導(dǎo)致糧堆內(nèi)外溫差加大，局部糧堆易出現(xiàn)霉變發(fā)熱的問題[2]，影響稻谷的儲存安全。因此，針對北方糧倉儲藏稻谷研究真菌的多樣性，分析儲藏環(huán)境對真菌分布的影響，通過監(jiān)測分析真菌變化情況，用以指導(dǎo)北方稻谷儲藏。

儲藏稻谷的真菌種類數(shù)量與其產(chǎn)區(qū)地理位置、收獲季節(jié)、氣候條件或儲藏方式有關(guān)[3]。早在20世紀(jì)80年代初，研究者曾對我國主要糧食，包括小麥、稻谷、玉米等的微生物多樣性做了初步的調(diào)查[4-6]，后來也有學(xué)者針對個別省份的稻谷真菌區(qū)系或多樣性進(jìn)行研究[7-8]。隨著研究的不斷深入，研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向儲藏條件對真菌的影響。田國軍等[9]發(fā)現(xiàn)在不同儲藏條件下由于上層稻谷受環(huán)境影響較大，其霉菌總數(shù)波動大于中、下層稻谷。周建新等[10]證實(shí)了稻谷儲藏過程中的微生物區(qū)系演替與儲藏溫度和水分有關(guān)，并指出稻谷發(fā)生霉變的優(yōu)勢菌大多是曲霉，如白曲霉、米曲霉和黃曲霉。這些真菌區(qū)系及多樣性的研究中，真菌的分離鑒定多以形態(tài)特征鑒定為主，部分菌種的鑒定可能存在不準(zhǔn)確或不確定性，有必要采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)輔以形態(tài)學(xué)對稻谷儲藏真菌多樣性進(jìn)行深入研究。

本研究選擇北方地區(qū)有代表性的高大平房倉儲藏的稻谷為研究對象，通過傳統(tǒng)的真菌形態(tài)特征鑒定與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合將儲藏稻谷中分離出的真菌基本鑒定到種?；跍?zhǔn)確的真菌鑒定結(jié)果，結(jié)合實(shí)際倉儲儲藏條件的變化，對真菌多樣性、真菌類型以及儲藏條件進(jìn)行分析，試圖找出指示北方稻谷儲藏條件變化的主要優(yōu)勢菌群及倉房重點(diǎn)關(guān)注位置，為北方倉儲過程監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參考2017年中國農(nóng)業(yè)年鑒，依據(jù)糧食產(chǎn)量在北方地區(qū)采集稻谷樣品。東北地區(qū)選擇黑龍江、吉林、遼寧，華北地區(qū)選擇北京，西北地區(qū)選擇寧夏。每個省選擇1個稻谷產(chǎn)量較高地區(qū)的糧庫，抽取1～2個具有代表性的高大平方倉，選擇儲存一年的稻谷倉進(jìn)行取樣。

每倉5點(diǎn)3層取樣，每點(diǎn)取200 g樣品，取樣點(diǎn)為糧倉的四個角加中間。3層的垂直分布為：上層(距離糧堆表面0.5 m左右)、中層(距糧面2～3 m左右)、底層(距離糧倉地面0.5 m左右)，取樣后將上、中、下層3層樣品按層分別混合。

1.2 方法

1.2.1 菌落計(jì)數(shù)、分離及純化

采用高鹽察氏(High-salt CA)和察氏(CA)2種培養(yǎng)基同時(shí)對樣品進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)和純化，具體操作步驟參考GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，每份樣品3個平行。計(jì)數(shù)時(shí)將不同表觀形態(tài)特征的菌落分別標(biāo)號，不同編號的菌株單獨(dú)進(jìn)行計(jì)數(shù)，挑取單菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接3～4次，純化不同編號真菌獲得純種菌株。樣品前處理過程為稱取25 g稻谷樣品至盛有225 mL無菌水的錐形瓶中，在振蕩器上振蕩30 min，充分洗滌后，制備10倍系列稀釋的樣品勻液，選擇2個適宜的稀釋梯度進(jìn)行接種。

1.2.2 真菌的表觀及顯微形態(tài)特征鑒定

表觀形態(tài)特征鑒定采用三點(diǎn)接種法(或單點(diǎn)接種法)在高鹽察氏培養(yǎng)(或察氏培養(yǎng)基)上接種，并置于(28±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征并拍照，將相同特征的真菌歸為一類進(jìn)行保藏。微觀形態(tài)特征鑒定采用斜插蓋玻片培養(yǎng)的方法，使菌絲沿著蓋玻片一側(cè)往上生長，培養(yǎng)5 d后取出蓋玻片，滴加乳酸—甘油固定液，在10×63倍的顯微鏡下觀察拍照。菌種表觀及顯微形態(tài)特征的鑒定參照 GB/T 4789.16—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定》、GB/T 26628.1—2011《糧油檢驗(yàn)儲糧真菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜》、《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》等資料。

1.2.3 真菌的分子生物學(xué)鑒定

采用液氮研磨和DNA提取試劑盒提取真菌DNA, 提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物為 ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)以及bT2a (5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和bT2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)[11,12]。用PCR提純試劑盒對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測有正確條帶后進(jìn)行測序。測序成功后用 BioEdit 軟件去除多余序列，保留波峰較整齊部分的序列，進(jìn)行拼接后得到ITS和β-微管蛋白基因序列，將得到的序列分別與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST同源序列比對，確定分離菌株的菌種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及真菌分類

對高鹽察氏和察氏培養(yǎng)基分離出的所有表觀形態(tài)特征略有差異的322株分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)合ITS和β-微管蛋白基因序列比對的同源序列結(jié)果以及真菌的形態(tài)特征，將分離出的菌株初步確定種屬名稱?；贗TS序列，采用最大似然法(Maximum likelihood)將所有分離菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對分離菌種的種屬進(jìn)一步確認(rèn)，并對所有真菌進(jìn)行分類分析。

由圖1可知，北方地區(qū)儲藏期稻谷共分離出真菌58種，分布在2門，4綱，6目，13科，16屬。屬水平分別為鏈格孢屬Alternaria、彎孢屬Curvularia、毛霉屬M(fèi)ucor、橫梗霉屬Lichtheimia、共頭霉屬Syncephalastrum、根毛霉屬Rhizomucor、附球菌屬Epicoccum、亞隔孢殼屬Didymella、枝孢屬Cladosporium、Gibellulopsis屬、帚枝霉屬Sarocladium、 木霉屬Trichoderma、鐮刀菌屬Fusarium、 藍(lán)狀菌屬Talaromyces、青霉屬Penicillium和曲霉屬Aspergillus，其中曲霉屬真菌種類最多為24種，青霉屬和鐮刀菌屬次之，分別為9種和7種。分離獲得的菌種以散囊菌目Eurotiales成員為最多，共計(jì)34種，分布在藍(lán)狀菌屬Talaromyces、青霉屬Penicillium和曲霉屬Aspergillus。非散囊菌目的其他菌種在系統(tǒng)樹上排布較為分散，分屬于5目，11科， 13屬。

通過系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，北方地區(qū)儲藏稻谷分離出的真菌種類較多。部分類群的ITS序列存在著極高的相似性，在種的劃分上很多分支自展支持率小于50%，特別是鏈格孢屬Alternaria、曲霉屬Aspergillus和青霉屬Penicillium真菌，表明ITS序列對真菌種水平上的鑒別能力不足，通過ITS測序僅可以將北方儲藏稻谷分離出的大部分真菌鑒定到屬，很少部分鑒定到種。因此對稻谷真菌多樣性進(jìn)行深入分析時(shí)，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征并補(bǔ)充其他特征引物條碼進(jìn)行分析。本研究對于ITS未確定到種的菌株，補(bǔ)測了β-微管蛋白基因的序列。β-微管蛋白是真核生物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器微管的成分之一，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)，通過β-微管蛋白編碼基因序列分析，大部分情況下可進(jìn)一步將屬水平或?qū)賰?nèi)復(fù)合群水平的真菌進(jìn)一步的鑒定到種[13]。綜合分析ITS和β-微管蛋白基因序列比對的同源序列結(jié)果及真菌形態(tài)特征，將322株分離菌株，確認(rèn)為58種真菌，55種真菌鑒定到種水平，有3株真菌未確定到種，但可以確認(rèn)分別為附球菌屬Epicoccum、鐮刀菌屬Fusarium和曲霉屬Aspergillus的物種。

注：分支下面數(shù)據(jù)表示該分支以bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)獲得50%以上的自展支持率。圖1 北方儲藏稻谷真菌基于ITS構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹及真菌分類

不同種類的真菌對于環(huán)境的適應(yīng)性不同，對于倉儲稻谷的潛在危害性也不同。針對這一點(diǎn)，國外學(xué)者通過系統(tǒng)研究，結(jié)合糧食收獲和儲藏環(huán)節(jié)，根據(jù)真菌生長適宜的水活度范圍對糧食真菌進(jìn)行了劃分[14]，如圖2所示。

圖2 基于真菌生長適宜水活度范圍的真菌分類[14]

由圖2可看出，糧食真菌主要分為3種類型：1)田間真菌，親水型植物病原真菌，糧食作物生長或收獲期侵染糧食籽粒；2)過渡真菌，對水活度要求相對寬泛，以腐生和嗜熱真菌為主，收獲前后污染谷穗和破碎顆粒或受傷的植株；3)儲藏真菌，嗜旱真菌，對水活度要求相對低，主要在糧食儲藏期間侵染糧粒[15]。本研究根據(jù)Mannaa等[14]和Fleurat-Lessard[15]對糧食真菌3種類型的總結(jié)，初步將北方地區(qū)儲藏稻谷分離到的全部真菌進(jìn)行劃分。因基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以表征不同菌株之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[16]，這里對文獻(xiàn)中未提及的部分真菌物種，根據(jù)其在系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關(guān)系相近的物種進(jìn)行聚類劃分，并對3種類型進(jìn)行標(biāo)注，具體分類標(biāo)注情況見圖1。同一類型真菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上基本聚在一起，這是由于糧食真菌對于水分和溫度的要求由其特征基因編碼決定的[17]。通過本研究將我國北方倉儲稻谷中分離出的真菌進(jìn)行全面準(zhǔn)確的鑒定，并進(jìn)行了分類，為北方稻谷儲藏狀況分析提供借鑒。

2.2 北方儲藏稻谷真菌菌落數(shù)及菌種豐度

糧食儲藏期間，侵染糧食的真菌以耐旱的儲藏真菌為主，從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，大部分真菌屬于曲霉屬。曲霉菌屬的部分成員(在之前的命名法中屬于散囊屬Eurotium的真菌)極易污染各種低水活度的生物基質(zhì)，特別是谷物及其制品[18-20]?！吨袊婢尽分薪榻B散囊屬Eurotium真菌都是嗜高滲透壓的，在一般的培養(yǎng)基上生長不良或不能生長，在低水活度培養(yǎng)基上才能生長正常[21]。因此，選取高鹽察氏培養(yǎng)基分離計(jì)數(shù)結(jié)果對后續(xù)儲藏稻谷的真菌菌落數(shù)、菌種豐度和優(yōu)勢菌群等進(jìn)行分析。真菌菌落總數(shù)和菌種豐度結(jié)果見表1。

表1 北方各省儲藏稻谷真菌菌落總數(shù)及菌種豐度

由表1可知，東北三省和華北地區(qū)北京真菌菌落數(shù)和菌種豐度相差不大，真菌菌落數(shù)基本處于1.0×103～ 2.2×103CFU/g的水平上，菌種豐度在16 ～ 21種。四個省區(qū)的稻谷在儲藏過程中基本實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)低溫儲藏，黑龍江和吉林因其外界自然低溫環(huán)境優(yōu)越，倉內(nèi)主要采用內(nèi)環(huán)流控溫或夜間開窗自然通風(fēng)降溫，遼寧和北京主要采用空調(diào)控溫。這4個省區(qū)糧庫，度夏期間，整倉平均溫度在10 ℃左右，上層溫度均控制在20 ℃左右，個別地區(qū)出現(xiàn)過25 ℃，但持續(xù)時(shí)間不長。因此，這些地區(qū)儲藏稻谷的真菌菌落數(shù)基本維持在初始帶菌量的水平，真菌豐度也沒有明顯變化。而西北寧夏糧庫稻谷真菌菌落數(shù)明顯增加，達(dá)到104CFU/g水平，表層菌種豐度明顯下降。寧夏該糧庫夏季高溫持續(xù)一段時(shí)間，但糧庫未采取控溫措施，追溯糧堆溫度數(shù)據(jù)，整倉平均溫度在15 ℃左右，上層曾出現(xiàn)過局部32 ℃ 高溫現(xiàn)象。綜合分析，寧夏上層稻谷水分和溫度偏高，為儲藏真菌生長提供了充足條件，致使真菌菌落數(shù)增加，高于正常儲藏時(shí)菌落數(shù)一個數(shù)量級，并成為優(yōu)勢菌群，使菌種豐度降為3種。

2.3 優(yōu)勢菌群分析

由于儲藏條件發(fā)生變化，真菌菌落數(shù)會明顯增加，具體哪些真菌會生長成為優(yōu)勢菌群值得關(guān)注。明確優(yōu)勢菌群的種類有助于監(jiān)控倉儲過程中主要危害真菌變化情況，為糧堆霉變防控提供技術(shù)指導(dǎo)。

對高鹽察氏培養(yǎng)基分離到的菌種進(jìn)行優(yōu)勢菌群分析，首先確定北方儲藏稻谷真菌的優(yōu)勢屬，再將優(yōu)勢屬中真菌放在一起進(jìn)行分析，占比小于1%的真菌種類歸為其他，優(yōu)勢屬和優(yōu)勢種比例關(guān)系如圖3所示。

由圖3可知，用高鹽察氏培養(yǎng)基分離時(shí)，北方儲藏稻谷優(yōu)勢屬主要為曲霉屬Aspergillus、枝孢屬Cladosporium和鏈格孢屬Alternaria，優(yōu)勢種為曲霉屬Aspergillus中的阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans，枝孢屬Cladosporium中的芽枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和Cladosporiumanthropophilum，鏈格孢屬Alternaria中的細(xì)極鏈格孢Alternariatenuissima和鏈格孢Alternariaalternata。

由2.1分析可以確定，鏈格孢屬Alternaria的細(xì)極鏈格孢Alternariatenuissima和鏈格孢Alternariaalternata屬于田間真菌，在收獲前期侵染稻谷，其生長對水活度要求較高。枝孢屬Cladosporium的芽枝狀枝孢Cladosporiumcladosporioides和Cladosporiumanthropophilum屬于過渡真菌，在收獲前后污染稻谷，其生長特性與田間真菌相似。這兩類真菌通常不會在儲藏期間大規(guī)模生長繁殖，主要分布在各省高大平方倉糧堆的中層和下層。本研究團(tuán)隊(duì)曾對北方新收獲入庫稻谷的真菌多樣性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明大部分北方稻谷入庫時(shí)就攜帶大量的枝孢屬真菌，這可能與北方稻谷收獲期間環(huán)境溫度有關(guān)。當(dāng)倉儲環(huán)境一直處于低溫、條件良好時(shí)(如糧堆中層和下層)，這些田間和過渡真菌仍保持收獲入庫時(shí)的優(yōu)勢比例。曲霉屬Aspergillus的阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans屬于儲藏真菌。這2種真菌有嗜高滲透壓的特性(耐旱性)[21]，能在低水活度的糧食中生長和繁殖，主要出現(xiàn)在寧夏糧庫糧堆上層。這類真菌是北方稻谷儲存過程中主要監(jiān)控的危害真菌種類。

圖3 儲藏稻谷優(yōu)勢屬和優(yōu)勢種分布情況

本研究分離出的優(yōu)勢菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans與擬灰綠曲霉Aspergilluspseudoglaucus、赤曲霉Aspergillusruber、篩曲霉Aspergilluscibarius、謝瓦曲霉Aspergilluschevalieri、Aspergillusmontevidensis5種真菌的形態(tài)特征和ITS序列很相近(見系統(tǒng)發(fā)育樹)，由于阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami、赤曲霉Aspergillusruber和謝瓦曲霉Aspergilluschevalieri歸屬于灰綠曲霉群[22]，故將這7種真菌統(tǒng)一歸為灰綠曲霉群及其近緣類群進(jìn)行分析，這個類群所有真菌均具有嗜高滲透壓的特性(耐旱性)[21]，屬于典型的儲藏真菌，其生長需要較低的水活度。由此可知，在稻谷儲存過程中，儲存條件不佳時(shí)，灰綠曲霉群及其近緣類群最先生長繁殖，數(shù)量快速增加逐漸取代其他真菌成為優(yōu)勢菌群，使真菌種群豐度下降。

2.4 儲藏環(huán)境對真菌分布的影響

從表1中真菌數(shù)量及豐度數(shù)據(jù)可以看出糧堆作為一個小生態(tài)環(huán)境，不同位置溫濕度不同，可能會影響到真菌分布情況。本研究根據(jù)糧堆環(huán)境差異特點(diǎn)，按照方法1.1進(jìn)行分層取樣，對3種類型的真菌在糧堆不同深度的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 北方儲藏稻谷不同深層位置真菌分布情況

由圖4可知，北方地區(qū)高大平房倉儲存稻谷時(shí)，糧堆不同深度，不同類型真菌分布存在一定差異。結(jié)合北方地區(qū)氣候特點(diǎn)，冬季干冷，糧庫通常會在冬季進(jìn)行通風(fēng)降溫蓄冷以備度夏。糧堆會保存自然冷心，糧堆中層和下層平均糧溫可控制在10 ℃或以下，夏季期間，上層稻谷易受外界環(huán)境影響，糧溫升高，平均溫度可達(dá)20～25 ℃，個別區(qū)域會出現(xiàn)30 ℃高溫，當(dāng)上層和中層稻谷溫差過大時(shí)可能出現(xiàn)水分遷移現(xiàn)象導(dǎo)致上層稻谷水分升高[23]，溫度和水分的上升，易導(dǎo)致儲藏真菌的生長。因此，在糧堆上層儲藏真菌占絕對優(yōu)勢，田間和過渡真菌的數(shù)量由于真菌之間的競爭抑制作用而降低。對于貼近糧倉墻面0.5 m左右的糧堆，當(dāng)墻體保溫隔熱效果不佳時(shí)，受環(huán)境溫度影響明顯，也可能出現(xiàn)這種情況。中層和下層稻谷因糧食導(dǎo)熱性差，受外界環(huán)境影響相對較小，會保持良好的低溫環(huán)境，田間真菌和過渡真菌占主要優(yōu)勢，基本維持在初始水平，大概范圍為1.0×103～3.3×103CFU/g，屬于正常環(huán)境真菌的檢出水平。

北方地區(qū)糧倉內(nèi)，當(dāng)儲藏真菌成為優(yōu)勢菌群后，田間和過渡真菌數(shù)量會明顯下降，這一不同類型真菌的生長和演替，主要受儲存條件變化的影響。北方儲藏稻谷主要優(yōu)勢菌為灰綠曲霉群及其近緣菌群，這類真菌生長一般不會導(dǎo)致糧堆發(fā)熱，但若不加以控制，可能會出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象，因此灰綠曲霉群及其近緣菌群可以作為糧堆發(fā)熱前預(yù)測預(yù)警的指示菌群[24]。

3 結(jié)論

北方地區(qū)儲藏期稻谷分離出的真菌種類較多，共分離純化出322株分離菌株，經(jīng)鑒定為58種真菌，分布于2門，4綱，6目，13科，16屬。本研究綜合分析ITS和β-微管蛋白基因序列以及真菌形態(tài)特征，將我國北方儲藏稻谷分離出真菌基本鑒定到種。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)合國外文獻(xiàn)對糧食中真菌類型的劃分，首次將我國北方倉儲稻谷中分離出的真菌進(jìn)行了分類，為北方稻谷儲藏狀況分析提供理論支撐。

通過對北方儲藏稻谷優(yōu)勢菌群和真菌類型的分析，將阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans與其他5種近緣曲霉劃為灰綠曲霉群及其近緣類群，這類真菌對于倉儲環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，儲存溫濕度增加時(shí)，首先萌發(fā)生長，數(shù)量增加，成為優(yōu)勢菌群。高大平房內(nèi)，糧堆上層或鄰近墻壁等位置受環(huán)境溫度的影響，容易出現(xiàn)高溫和水分遷移的情況，為儲藏真菌生長提供條件，使優(yōu)勢菌群由初始的田間和過渡真菌演替為儲藏真菌，若不加以處理可能導(dǎo)致糧堆發(fā)熱，引起儲存稻谷品質(zhì)的劣變，嚴(yán)重影響儲糧安全。綜上所述，我國北方地區(qū)儲藏期稻谷分離出的真菌種類繁多，真菌菌落總數(shù)范圍在103～ 104CFU/g之間。優(yōu)勢菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans被劃分為灰綠曲霉群及其近緣類群，可作為北方糧堆異常糧情早期監(jiān)測預(yù)警的主要指示菌群，高大平方倉中糧堆上層和鄰近墻壁等位置是北方倉儲過程中主要關(guān)注的區(qū)域。