許年鳳 章小華 白露 雷艾華 王宏亮

肝硬化是指慢性肝損傷導(dǎo)致門脈高壓和終末期肝病的再生結(jié)節(jié)周圍纖維帶的組織學(xué)發(fā)展[1]。目前正在研發(fā)能夠阻止失代償性肝硬化進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)肝硬化的藥物療法[2]。隨著彩色超聲儀器的普及，彩色多普勒超聲在診斷肝硬化中越來越多使用[3]。肝硬化與腸屏障功能障礙和腸道通透性增加有關(guān)。肝硬化中的腸屏障功能障礙及其相關(guān)機(jī)制具有重要的臨床意義，它與肝硬化嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)[4]。腸上皮由單層上皮細(xì)胞組成，緊密連接在頂端表面，似乎是決定腸道通透性的最重要因素[5]。肝硬化導(dǎo)致腸細(xì)胞緊密連接的顯著改變，這是腸通透性高的一個(gè)重要致病機(jī)制。黏膜屏障也依賴于上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，而上皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是由細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡決定的，后者調(diào)節(jié)腸細(xì)胞的轉(zhuǎn)換和黏膜細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞因子是負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)大多數(shù)生物學(xué)效應(yīng)的激素信使。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞因子的主要來源，T淋巴細(xì)胞有兩個(gè)主要的亞群，以細(xì)胞表面分子CD4和CD8的存在為特征。表達(dá)CD4的T淋巴細(xì)胞也被稱為輔助性T細(xì)胞。這一亞群可進(jìn)一步細(xì)分為Th1和Th2，它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子被稱為Th1型細(xì)胞因子和Th2型細(xì)胞因子。Th1型細(xì)胞因子傾向于產(chǎn)生原炎性反應(yīng)，該反應(yīng)負(fù)責(zé)殺死細(xì)胞內(nèi)寄生蟲并使自身免疫反應(yīng)持續(xù),干擾素γ是主要的Th1細(xì)胞因子[6]。Th2型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13，這些細(xì)胞因子與特應(yīng)性免疫球蛋白(IgE)和嗜酸細(xì)胞反應(yīng)的促進(jìn)有關(guān)，也包括IL-10，后者具有更多的抗炎反應(yīng)。Th2反應(yīng)將抵消Th1介導(dǎo)的殺菌作用[7]。Th1和Th2細(xì)胞因子平衡的改變與多種免疫相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后密切相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年1月36例患者作為研究對(duì)象。36例受檢者根據(jù)患者情況分為對(duì)照組(n=12)，由年齡和性別相匹配的健康人組成，接受上消化道內(nèi)鏡檢查，沒有病理發(fā)現(xiàn)。代償性肝硬化(n=12)，失代償性肝硬化(n=12)。失代償性或代償性疾病的分類基于Child-Pugh分類；Child-Pugh A被分類為代償性肝硬化，Child-Pugh B或C被分類為代償性肝硬化。所有參與研究的患者都接受了上消化道內(nèi)窺鏡檢查，在檢查過程中，活組織檢查從十二指腸的第二部分獲取。3組患者一般情況(年齡、體重、性別比例、體重指數(shù))比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料對(duì)比 n=12

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：性別不拘；年齡30～70歲；如果患者被診斷為肝硬化(病毒性、酒精性或其他病因)，則有資格納入本前瞻性研究。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤、糖尿病、風(fēng)濕性疾病、腎臟疾病、胃腸道疾病(如腹腔疾病、炎癥性腸病、過去四周胃腸道出血)或腸道手術(shù)、感染包括自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(過去4周)、過去4周酗酒。服用血清或尿淀粉酶升高和治療的藥物，如抗生素，皮質(zhì)類固醇，非甾體類抗炎藥和抗氧化劑(維生素C和E，別嘌呤醇，N-乙酰半胱氨酸)。

1.2.3 醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題：所有參與研究的患者均得書面知情同意；依據(jù)臨床指南的相關(guān)原則充分保障患者的治療安全;對(duì)患者診療記錄進(jìn)行保密，保護(hù)患者的隱私權(quán)。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)毒素測(cè)定：在內(nèi)窺鏡檢查之前，所有患者都要從外周靜脈進(jìn)行血液取樣以測(cè)量?jī)?nèi)毒素。血液樣本在無內(nèi)毒素的小瓶中收集，然后分離血漿，并在-80℃下儲(chǔ)存，直到處理。內(nèi)毒素濃度通過定量顯色鱟-阿米巴細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(LAL，QCL-1000，Lonza，Walkersville，MD，USA)測(cè)定，并以EU/ml表示。樣品按照說明書進(jìn)行處理。

1.3.2 腸道脂質(zhì)氫過氧化物(looh)測(cè)定：腸道樣本在0.1 ml 10 mm磷酸鹽緩沖液(pH值7.2)中均勻化(使用微管裝)，為蛋白質(zhì)定量10 μl。用0.09 ml氯仿：甲醇(2∶1，v∶v)萃取19份勻漿，離心(15 000 g，5 min)，氯仿層真空干燥，用0.25 ml甲醇溶解。

1.3.3 腸黏膜增殖和凋亡的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)：十二指腸活檢用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精和伊紅染色。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞用合適的fitc-、藻紅蛋白或cychrome結(jié)合abs在PBS中培養(yǎng)30 min，其中0.1%胎牛血清和0.02 mmol/L NaN3。細(xì)胞質(zhì)CTLA-4由細(xì)胞內(nèi)染色確定。用5-和6-羧基氟烷二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CFSE；Molecular Probes，Inc.，Eugene，or)標(biāo)記純化的CD4細(xì)胞。清洗后，在facscan(加利福尼亞州圣何塞市Becton Dickinson)上分析標(biāo)記的細(xì)胞樣品。

1.3.5 細(xì)胞因子和生化參數(shù)：通過免疫化學(xué)發(fā)光分析測(cè)定腫瘤壞死因子α(TNF-α)；化學(xué)發(fā)光分析測(cè)定白介素-6(IL-6)；cent分析IL-4；酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定IL-10，此外，患者進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室評(píng)估，包括凝血酶原活性、血清白蛋白、膽紅素和IgG，計(jì)算作為Th1/Th2激活替代標(biāo)記物的IFN-γ/IL-10、IFN-γ/IL-4和IFN-γ/IL-13的比值。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素測(cè)定 失代償和代償組內(nèi)毒素濃度較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。見表2。

組別內(nèi)毒素對(duì)照組 1.25±0.13代償肝硬化組 4.35±2.02*失代償肝硬化組4.35±0.34*F值6.472P值0.002

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 腸道脂質(zhì)氫過氧化物 失代償期肝硬化組的腸道脂質(zhì)過氧化顯著增加(P<0.05)。見表3。

2.3 腸黏膜有絲分裂和凋亡活性 在每個(gè)腸黏膜標(biāo)

組別looh/ml對(duì)照組 2.45±2.65代償肝硬化組 4.67±0.98*失代償肝硬化組3.25±4.67*#F值8.439P值0.006

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與代償肝硬化組比較，#P<0.05

本中，通過形態(tài)學(xué)分析鑒定和計(jì)數(shù)腸上皮的有絲分裂和凋亡體。代償性和失代償性肝硬化組的黏膜有絲分裂計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。細(xì)胞凋亡有增加的趨勢(shì)(P<0.05)。與對(duì)照組比較，B組和C組的有絲分裂/凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 健康受試者(A)和代償性肝硬化患者(B)腸上皮細(xì)胞有絲分裂的顯微照片(紅色箭頭，HE×200)；失代償性肝硬化患者(C)腸上皮細(xì)胞凋亡體的檢測(cè)(紅色箭頭，HE×200)

表4 腸黏膜有絲分裂計(jì)數(shù)、凋亡計(jì)數(shù)及其比值

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與代償肝硬化組比較，#P<0.05

2.4 細(xì)胞因子 代償性肝硬化組和失代償性肝硬化組IL-4、IL-13、TNF-α、IL-6水平均高于對(duì)照組(P<0.05)。失代償肝硬化組TFN-γ低于對(duì)照組、代償性肝硬化組(P<0.05)，IL-4高于對(duì)照組，低于代償性肝硬化組(P<0.05)，IL-10、IL-13、TNF-α、IL-6水平均高于對(duì)照組、代償性肝硬化組(P<0.05)。見表5。

項(xiàng)目對(duì)照組代償肝硬化組失代償肝硬化組F值P組IFN-γ(pg/ml)6.25±7.625.64±5.605.09±2.56*#0.3620.000IL-4 (ng/ml)0.93±1.621.79±5.30*1.15±1.34*#3.1650.000IL-10 (pmol/L)11.50±26.6710.75±5.9513.69±10.11*#13.519 0.001IL-13 (pg/ml)10.76±21.3021.68±28.07*25.38±34.01*#6.858 0.033TNF-α (pg/ml)4.80±1.826.31±2.20*8.09±4.69*#12.971 0.002IL-6 (pg/ml)5.89±4.307.19±4.74*9.96±12.81*#4.5150.000

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與代償性肝硬化組比較，#P<0.05

3 討論

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，由一種或多種病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害[8]。肝硬化反復(fù)證實(shí)腸道通透性增加，腸上皮似乎是決定腸通透性的最重要因素，在肝硬化患者的腸上皮中，TJ相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的表達(dá)下降，在細(xì)胞水平上，促進(jìn)了腸通透性的增加。腸屏障功能完整性與腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。腸上皮細(xì)胞增殖顯著減少，凋亡趨勢(shì)增加。肝硬化患者腸道的增殖/凋亡率明顯降低。在代償性和失代償性肝硬化患者中同時(shí)檢測(cè)到黏膜細(xì)胞的變化，而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組肝硬化患者存在腸屏障功能障礙和顯著內(nèi)毒素血癥。腸道屏障功能障礙和腸道通透性高發(fā)生在肝硬化的早期。在失代償性疾病患者中觀察到的腸道源性內(nèi)毒素血癥的更大程度可歸因于導(dǎo)致該組腸道屏障紊亂的其他因素，肝硬化與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[9]。在肝硬化患者的血液和肝組織中檢測(cè)到氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝線粒體功能障礙。在失代償性疾病中觀察到，失代償性疾病是一種重要的氧化應(yīng)激啟動(dòng)子，通過激活全身炎性反應(yīng)，并在肝病中耗盡肝細(xì)胞抗氧化防御[10，11]。代償性肝硬化患者的腸道細(xì)胞發(fā)生了改變。沒有紅色同時(shí)出現(xiàn)的腸道高氧化應(yīng)激，表明其他因素，如全身內(nèi)毒素血癥，可能與肝病早期腸道黏膜異常有關(guān)。然而，在失代償性肝硬化中，腸道氧化性很高。通過抑制細(xì)胞增殖和破壞緊密連接結(jié)構(gòu)復(fù)合體，應(yīng)激可能在進(jìn)一步損害黏膜屏障完整性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

在研究中，患者的IFN-γ水平仍高于對(duì)照組，而IL-13和IL-10水平也較高。IL-13是主要由Th-2細(xì)胞產(chǎn)生。IL-13促進(jìn)纖維生成，但也刺激基質(zhì)金屬蛋白酶。它還具有多種抗炎功能[12]。IL-10主要由2型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生。作為一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，對(duì)Th1和Th2淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞具有抑制作用[13，14]。因此，發(fā)現(xiàn)患者的IL-13和IL-10水平可能導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)作用[15，16]?；颊叩腎FN-γ水平也高于對(duì)照組，表明Th1淋巴細(xì)胞活性增加。

總之，研究表明肝硬化與腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的顯著改變有關(guān)，通過減少黏膜增殖和增殖/凋亡率來證明。失代償性疾病與高水平的腸道氧化應(yīng)激有關(guān)?；謴?fù)腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)和減少腸氧化應(yīng)激的治療劑，如腸免疫營(yíng)養(yǎng)(谷氨酰胺)、益生菌、抗氧化劑和腸道調(diào)節(jié)肽(蛙皮素、神經(jīng)降壓素)，可能對(duì)肝硬化患者具有潛在價(jià)值。在肝硬化患者中，Th1細(xì)胞因子，如IFN-γ，在主要Th2衍生細(xì)胞因子IL-4水平較低的情況下升高。IL-10是一種抗炎性細(xì)胞因子，它的產(chǎn)生與肝功能損害有關(guān)。與IL-4相比，肝硬化患者的IL-13增加。盡管由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，其他類型的細(xì)胞也分泌這種細(xì)胞因子，它除了促進(jìn)纖維生成外，還與IL-10一起發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，在肝硬化患者中，Th1活性增加，同時(shí)IL-10和IL-13水平增加。