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        雙酶法制備牡蠣干酶解液及其體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

        2020-06-13 01:35:44龐忠莉鄭建仙
        食品與機(jī)械 2020年4期
        關(guān)鍵詞:解液牡蠣清除率

        龐忠莉 - 鄭建仙 -

        (華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)

        牡蠣又稱海蠣子、蠔,是中國(guó)衛(wèi)生部首批藥食兩用原料之一[1]。牡蠣中富含蛋白質(zhì)、糖原、多不飽和脂肪酸和多種人體必需氨基酸等生物活性物質(zhì)。干牡蠣肉中蛋白質(zhì)含量高達(dá) 45%~57%,其中必需氨基酸質(zhì)量比例和完善程度要優(yōu)于人乳和牛乳[2],糖原含量為20%~40%,脂肪僅占7%~10%。

        蛋白質(zhì)通過(guò)酶工程技術(shù)加工可獲得富含多種氨基酸及小分子多肽的酶解物。相較于蛋白質(zhì),小分子多肽具有提供能量迅速、消化吸收利用率高、促進(jìn)物質(zhì)代謝、低毒性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[3]。利用動(dòng)物蛋白水解酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)動(dòng)物蛋白水解,具有水解效率高,產(chǎn)物風(fēng)味好、苦味低的特點(diǎn)[4-5]。因此,酶解技術(shù)的應(yīng)用一直是牡蠣高值化開(kāi)發(fā)的重要手段,尤其是利用牡蠣蛋白制備生物活性肽一度成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前已有的研究大多以新鮮牡蠣肉為酶解對(duì)象,大量研究表明牡蠣蛋白源的生物活性肽具有抗菌[6]、降血壓[7]、抗氧化[8-9]、抗疲勞等多種生理功效,是開(kāi)發(fā)功能性食品的優(yōu)質(zhì)基料。Wang等[10]對(duì)比了牡蠣及牡蠣堿性蛋白酶解物的體內(nèi)及體外抗氧化活性,結(jié)果表明無(wú)論在體內(nèi)還是體外,牡蠣酶解物的抗氧化活性均顯著高于牡蠣本身。

        牡蠣是中國(guó)第一大經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類,其產(chǎn)量位于世界之首。然而當(dāng)前牡蠣利用仍然以生銷和制備耗油為主。較新鮮牡蠣而言,牡蠣干來(lái)源不受季節(jié)限制,儲(chǔ)藏期長(zhǎng),價(jià)格低廉,更適合作為工業(yè)化生產(chǎn)的原料。研究擬以來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉的牡蠣干為研究對(duì)象,選用動(dòng)物蛋白水解酶及風(fēng)味蛋白酶對(duì)牡蠣干蛋白進(jìn)行深度復(fù)合酶解,獲得富含多種氨基酸及小分子活性多肽的牡蠣酶解液,并對(duì)該酶解物進(jìn)行體外抗氧化評(píng)價(jià)試驗(yàn)。旨在為牡蠣干的精深加工、提高牡蠣相關(guān)制品附加值開(kāi)辟一條可行性的路徑提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        牡蠣干:廣西北海市海城區(qū)市售;

        動(dòng)物蛋白水解酶:10萬(wàn)U/g,南寧龐博生物有限公司;

        風(fēng)味蛋白酶:2萬(wàn)U/g,南寧龐博生物有限公司;

        DPPH:美國(guó)Sigma公司;

        ABTS、生育酚:美國(guó)Aldrich公司;

        甲醛:湖北奧生新材料科技有限公司;

        其他試劑:分析純。

        1.2 主要儀器

        水浴恒溫振蕩器:SHA-C型,江蘇省金壇市農(nóng)儀器廠;

        高速冷凍離心機(jī):GL-21M型,長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;

        自動(dòng)凱氏定氮儀:KDN-103F型,上海纖檢儀器有限公司;

        消化爐:HYP-308型,上海纖檢儀器有限公司;

        數(shù)顯pH計(jì):PHS-25型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;

        分光光度計(jì):22PC型,上海棱光技術(shù)有限公司;

        冷凍干燥機(jī):SCIENTZ-10N型,寧波新芝生物科技股份有限公司;

        全自動(dòng)氨基酸分析儀:L-8900型,日本Hitachi公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 牡蠣干的酶解

        (1) 酶解工藝流程:

        牡蠣干除雜及去內(nèi)臟→粉碎→過(guò)60目篩→按一定比例加蒸餾水→調(diào)節(jié)適宜pH,加酶酶解→沸水浴滅酶10 min→4 000 r/min離心10 min→取上清待測(cè)

        (2) 酶解的單因素試驗(yàn):固定加酶量3%,動(dòng)物蛋白水解酶∶風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶1,酶解時(shí)間3 h,溫度50 ℃,設(shè)定料液比為1∶5,1∶10,1∶15,1∶20 (g/mL);固定加酶量3%,50 ℃,動(dòng)物蛋白水解酶∶風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶1,料液比1∶10 (g/mL),設(shè)定酶解時(shí)間為2,3,4,5,6 h;固定時(shí)間3 h,50 ℃,動(dòng)物蛋白水解酶∶風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比1∶1,料液比1∶10 (g/mL),設(shè)定加酶量為1%(總酶活/底物=600 U/g),2%(總酶活/底物=1 200 U/g),3%(總酶活/底物=1 800 U/g),4%(總酶活/底物=2 400 U/g),5%(總酶活/底物=3 000 U/g);固定加酶量3%,料液比1∶10(g/mL),酶解時(shí)間3 h,溫度50 ℃,設(shè)定復(fù)合酶質(zhì)量配比(動(dòng)物蛋白水解酶∶風(fēng)味蛋白酶)為4∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶4。以水解度為指標(biāo),對(duì)各單因素進(jìn)行試驗(yàn),每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

        (3) 酶解條件正交優(yōu)化試驗(yàn):在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,以水解度為指標(biāo),對(duì)酶解時(shí)間、加酶量、料液比進(jìn)行三因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

        1.3.2 水解度的測(cè)定 參照周慧江等[11]的方法,并作以下修改:取8 mL酶解液于燒杯中,加入60 mL無(wú)二氧化碳蒸餾水,開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器,滴加0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH=8.2,再加入10 mL的中性甲醛,再滴加0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液使pH=9.2,記錄加入甲醛后消耗的NaOH體積為V1。取等質(zhì)量底物的未酶解液,進(jìn)行上述操作,作空白試驗(yàn),記V0。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行。按式(1)計(jì)算牡蠣蛋白的水解度。

        (1)

        式中:

        DH——水解度,%;

        c——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;

        V1——酶解液中加入甲醛后消耗NaOH的體積,mL;

        V0——未酶解液中加入甲醛后消耗NaOH的體積,

        mL;

        V——酶解液的總體積,mL;

        m——酶解底物的質(zhì)量,g;

        N——酶解底物的總氮含量,g;

        0.014——氮的毫克當(dāng)量。

        1.3.3 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定 參考GB 5009.5—2016方法采用凱氏定氮儀進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定,按式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

        (2)

        式中:

        m1——酶解液中蛋白質(zhì)含量,g;

        m2——原料中蛋白質(zhì)含量,g。

        1.3.4 酶解液氨基酸的測(cè)定 參考GB 5009.124—2016采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.5 體外抗氧化活性測(cè)定

        (1) DPPH自由基清除能力:參照Shyu等[12]的方法稍作修改。用無(wú)水乙醇配置0.2 mmol/L DPPH溶液,取適量酶解液按體積比1∶1與0.2 mmol/L的DPPH混合,室溫下避光反應(yīng)30 min,記為A1;無(wú)水乙醇與等量酶解液混合,記為A2;無(wú)水乙醇與等量0.2 mmol/L的DPPH混合,記為A0。以VE做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。每組平行測(cè)定3次取平均值。按式(3)計(jì)算DPPH自由基的清除率。

        (3)

        式中:

        a——DPPH自由基的清除率,%;

        A1——加入試樣組的吸光值;

        A2——不加DPPH的樣液吸光值;

        近年來(lái),隨著核桃進(jìn)入豐產(chǎn)期,拜城縣大部分核桃園存在著許多低產(chǎn)低質(zhì)的雜品種、實(shí)生核桃樹(shù),嚴(yán)重影響了拜城縣核桃產(chǎn)量。且品種混雜造成了拜城縣核桃品質(zhì)差,價(jià)格低,嚴(yán)重影響了拜城縣核桃種植農(nóng)戶的收入。

        A0——未加試樣組的吸光值。

        (2) 羥基自由基清除能力:采用Fonton反應(yīng)—水楊酸法測(cè)定羥基自由基清除能力。向試管加入試樣和9 mmol/mL水楊酸—乙醇溶液、9 mmol/mL硫酸亞鐵溶液及8.8 mmol/mL過(guò)氧化氫溶液各1 mL。37 ℃恒溫下反應(yīng)30 min,510 nm處測(cè)定吸光度值。以VC做陽(yáng)性對(duì)照。每組平行測(cè)定3次。按式(4)計(jì)算羥基自由基的清除率。

        (4)

        式中:

        b——羥基自由基的清除率,%;

        A0——不加試樣組的吸光度;

        A1——加試樣時(shí)的吸光度。

        (3) ABTS自由基清除能力:配制含有7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液的ABTS+·溶液,使用前在黑暗室溫環(huán)境中放置12~16 h,使用時(shí)用乙醇稀釋ABTS+·溶液,使其在734 nm下吸亮度值為0.70±0.02。取0.2 mL樣品液,加入7.8 mL上述稀釋后的ABTS+·溶液,在室溫下反應(yīng)6 min,然后在734 nm處測(cè)定其吸光度值[3]。以VE做陽(yáng)性對(duì)照。按式(4)計(jì)算ABTS自由基的清除率。

        1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并作圖及使用SPSS 22.0中的最小顯著性差異法(Least-Significant Difference,LSD)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酶解單因素試驗(yàn)

        2.1.1 料液比對(duì)水解度的影響 水是酶解反應(yīng)中重要的反應(yīng)介質(zhì)和運(yùn)輸載體。適量的水可以使原料肌肉組織吸水膨脹,結(jié)構(gòu)變得疏松,提高酶與蛋白的反應(yīng)幾率;而且水可以使產(chǎn)物快速分散,避免局部濃度過(guò)高,對(duì)酶解形成抑制。然而,水分含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致有效的酶濃度降低,酶解速率也會(huì)隨之減緩,此外過(guò)低的底物濃度會(huì)導(dǎo)致酶自溶[13]。如圖1所示,牡蠣蛋白水解度隨加液量的增加而增大,料液比為1∶15 (g/mL)時(shí)水解度增長(zhǎng)的幅度基本趨于平緩。因此以料液比1∶15 (g/mL)作為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的參考。

        字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 料液比對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響

        Figure 1 Effect of material to liquid ratio on the degree of hydrolysis of oyster protein

        2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖2可以看出:牡蠣蛋白水解度隨時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高,5 h之后基本趨于平緩,是由于水解前期底物充足,酶活高。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)不僅酶活力下降,產(chǎn)物濃度不斷提高,從而一定程度上限制了酶促反應(yīng)的進(jìn)行。通過(guò)方差分析可知,5 h之前,不同的酶解時(shí)間對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響存在顯著差異(P<0.05)。因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇3~5 h進(jìn)行酶解時(shí)間優(yōu)化。

        2.1.3 加酶量對(duì)水解度的影響 酶解反應(yīng)中,加酶量影響著酶解效率,一般而言,加酶量越大蛋白酶解效率和程度越高,但當(dāng)酶用量大于適宜濃度時(shí),容易導(dǎo)致酶自溶增強(qiáng)[14],從而影響酶解效率。從圖3可以看出,隨著加酶量的增大水解度先增大后趨于平緩,當(dāng)酶添加量>3%后,蛋白水解度基本不變,因此選用3%作為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的參考點(diǎn)。

        2.1.4 復(fù)合酶質(zhì)量酶比對(duì)水解度的影響 從圖4可以看出:隨著風(fēng)味蛋白酶相對(duì)添加量的增加,牡蠣蛋白水解度基本處于下降的趨勢(shì),表明相對(duì)于動(dòng)物蛋白水解酶而言,風(fēng)味蛋白酶對(duì)牡蠣干蛋白的酶解結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)較少,酶切范圍相對(duì)較小。動(dòng)物蛋白水解酶∶風(fēng)味蛋白酶=4∶1時(shí)的牡蠣蛋白水解度顯著(P<0.05)高于其他酶比條件下的水解度,因此選取酶比(動(dòng)物蛋白水解∶風(fēng)味酶)為4∶1用于后續(xù)試驗(yàn)。

        字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 酶解時(shí)間對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響

        Figure 2 Effect of time on the degree of hydrolysis of oyster protein

        字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 加酶量對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響

        Figure 3 Effect of amount of enzyme on the degree of hydrolysis of oyster protein

        字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 酶比對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響

        Figure 4 Effect of enzymatic ratio on the degree of hydrolysis of oyster protein

        2.2 酶解正交優(yōu)化試驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,確定的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

        表1 牡蠣干酶解的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        Table 1 Orthogonal experimental design of enzymatic hydrolysis of dried oyster

        水平A 時(shí)間/hB 料液比(g/mL)C 總酶量/%131∶102241∶153351∶204

        由表2可知,通過(guò)極差分析得到各因素對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響主次順序?yàn)椋簳r(shí)間>料液比>加酶量。此外,由RA、RB均大于空列的極差可得酶解時(shí)間及料液比對(duì)水解度存在影響是可靠的。正交優(yōu)化試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A3B2C3,通過(guò)驗(yàn)證對(duì)比試驗(yàn)得到最優(yōu)組合下的水解度為33.95%,稍微大于水解度最高試驗(yàn)組A3B3C2。由于加酶量對(duì)水解度的影響較小,綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本,選取加酶量為3%,將A3B3C2定為最優(yōu)酶解工藝組合。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明:此組合下牡蠣酶解的平均水解度為33.7%(n=3),蛋白質(zhì)平均回收率達(dá)78.75%。

        表2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal optimization experiment results

        2.3 牡蠣酶解液的氨基酸分析

        如圖5及表3所示,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定牡蠣干酶解液中總氨基酸,可以測(cè)出17種氨基酸。采用峰面積歸一化法計(jì)算得出:必需氨基酸占總氨基酸含量的38.93%,其中谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸含量豐富。必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比例為63.74%。符合FAO/WHO的理想模式:EAA/TAA為40%左右,EAA/NEAA為60%以上。因此可以得出該牡蠣酶解液氨基酸種類齊全且營(yíng)養(yǎng)豐富。

        2.4 牡蠣酶解液體外抗氧化試驗(yàn)

        2.4.1 DPPH自由基清除能力 如圖6、7所示,牡蠣酶解液及生育酚對(duì)DPPH自由基的清除率均隨濃度的增大而不斷升高,且均具有顯著的正相關(guān)性(P<0.01)。Dong等[15]探究了大連灣牡蠣肉蛋白酶解物的抗氧化活性,結(jié)果表明DPPH自由基清除能力與牡蠣酶解物濃度存在顯著的量效關(guān)系,與試驗(yàn)結(jié)果相似。根據(jù)線性方程分別可得出生育酚對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50=11.72 μg/mL,牡蠣酶解液對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50=5.95 mg/mL。

        圖5 酶解液氨基酸分析圖譜Figure 5 The map of amino acid analysis of hydrolysate

        表3 酶解液中氨基酸的組成?Table 3 Amino acid composition of hydrolysate

        ? *表示必需氨基酸(EAA)。

        2.4.2 羥基自由基清除能力 羥基自由基是生命體內(nèi)存在最活躍的活性氧,幾乎可以與機(jī)體內(nèi)所有的細(xì)胞成分反應(yīng),破壞力極強(qiáng)。如圖8所示,當(dāng)VC濃度為1 mg/mL

        圖6 生育酚對(duì)DPPH自由基的清除作用

        Figure 6 Effect of tocopherol on DPPH free radical scavenging

        圖7 牡蠣酶解液對(duì)DPPH自由基的清除作用

        Figure 7 Effect of oyster hydrolysate on DPPH free radical scavenging

        圖8 VC對(duì)羥基自由基的清除作用

        Figure 8 Effect of vitamin C on hydroxyl free radical scavenging

        圖9 牡蠣酶解液對(duì)羥基自由基的清除作用

        Figure 9 Effect of oyster hydrolysate on hydroxyl free radical scavenging

        時(shí),其對(duì)羥基清除率達(dá)到98.8%,其半數(shù)清除率IC50=589.15 μg/mL。如圖9所示牡蠣酶解液對(duì)羥基自由基清除率隨濃度的增大不斷提高,且具有顯著的正相關(guān)性(P<0.01),其半數(shù)清除率IC50=14.56 mg/mL。

        2.4.3 ABTS自由基清除能力 如圖10、11所示,生育酚及牡蠣蛋白酶解液對(duì)ABTS自由基的清除率均隨濃度的增大而顯著提高(P<0.01),結(jié)合線性方程可得生育酚對(duì)ABTS自由基的半數(shù)清除率(IC50)為118.1 μg/mL,牡蠣蛋白酶解液對(duì)ABTS自由基的半數(shù)清除率IC50=10.80 mg/mL。

        圖10 生育酚對(duì)ABTS自由基的清除作用

        Figure 10 Effect of tocopherol on ABTS free radical scavenging

        圖11 牡蠣酶解液對(duì)ABTS自由基的清除作用

        Figure 11 Effect of oyster hydrolysate on ABTS free radical scavenging

        3 結(jié)論

        研究選用動(dòng)物蛋白水解酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)合對(duì)牡蠣干進(jìn)行深度酶解,進(jìn)一步探究了最優(yōu)酶解工藝得到的牡蠣干蛋白酶解物的體外抗氧化活性。研究結(jié)果顯示該牡蠣干蛋白水解物清除DPPH自由基的IC50=5.95 mg/mL,清除ABTS自由基的IC50=10.8 mg/mL,清除羥基自由基的IC50=14.56 mg/mL。表明在該研究的酶解條件下得到的牡蠣干酶解物具備一定抗氧化能力。

        但牡蠣干酶解液腥味較重,限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用,因此在今后的研究中可繼續(xù)探究酶解液的風(fēng)味改善方法及腥味產(chǎn)生的機(jī)制?;蛘呖蛇M(jìn)一步對(duì)酶解液中的活性多肽進(jìn)行分離純化,結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)探究其抗氧化活性機(jī)制。最終可作為功能性基料用于開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)豐富、具有保健功能的食品,從而提升牡蠣產(chǎn)業(yè)的整體經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。

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