扎西吉，咸育婷

青海省第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海 西寧 810000

自身免疫性肝病是一種因自身免疫功能失調(diào)發(fā)生的慢性肝病，主要包括自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎，其中自身免疫性肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化較為常見(jiàn)。自身免疫性肝病在女性中發(fā)病率高于男性，且由于遺傳,環(huán)境中物理、化學(xué)等因素影響，近年來(lái)自身免疫性肝病發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)[1]。探究自身免疫性肝病進(jìn)展中相關(guān)影響因子，有助于病情及時(shí)評(píng)估和患者預(yù)后改善。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells, Treg)的相互作用在維持機(jī)體免疫環(huán)境穩(wěn)定中有重要意義。有研究報(bào)道，Th17/Treg平衡與肝臟疾病[2]及自身免疫性疾病[3]發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Thorlaciusussing等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在潰瘍性結(jié)腸炎組織中表達(dá)水平較對(duì)照組高，可作為潰瘍性結(jié)腸炎生物標(biāo)志物，用于疾病診斷。Singh等[5]研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中miR-155高表達(dá)，與患者臨床病理特征有關(guān)，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎潛在標(biāo)志物。由于miR-21、miR-155在免疫性肝病中表達(dá)水平及與Th17/Treg水平關(guān)系鮮有研究，本研究通過(guò)檢測(cè)自身免疫性肝病患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平，分析二者與Th17/Treg水平相關(guān)性，探究二者在自身免疫性肝病中意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年6月至2019年6月本院收治的自身免疫性肝病患者122例作為研究對(duì)象，男38例，女84例，年齡(48.63±14.21)歲(25～76歲)。根據(jù)自身免疫性肝炎[6]和原發(fā)性膽汁性肝硬化[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，將入組患者分為：自身免疫性肝炎59例，原發(fā)性膽汁性肝硬化63組。納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為自身免疫性肝病;(2)臨床資料完整;(3)患者及家屬均表示知情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、腎功能嚴(yán)重不足者;(2)患有嚴(yán)重精神疾病者;(3)患有其他部位疾病者。另選取同期在本院健康體檢者61名作為健康對(duì)照組，男19名，女42名，年齡(49.57±16.03)歲(24～73歲)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要儀器和試劑qRT-PCR儀(型號(hào)：ABI 7500，美國(guó)ABI公司)、流式細(xì)胞儀(型號(hào)：FACSCalibur，美國(guó)BD公司)、總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：R1200-100，北京索萊寶科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RP1105，北京索萊寶科技有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：RR820A，大連寶生物公司)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：kl-001，上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：所有入組者于清晨(7：00～9：00)空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血5 ml，一部分離心20 min(4 ℃、3 000 r/min)后收集血清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，另一部分用于qRT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qRT-PCR法檢測(cè)外周血miR-21及miR-155水平：采用RNA提取試劑盒提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。20 μl反應(yīng)體系如下：SYBR? Mix Taq Ⅱ 10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。具體反應(yīng)步驟如下：95 ℃、33 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、5 s；62 ℃、35 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，用2-△△CT法計(jì)算miR-21、miR-155表達(dá)水平，所用引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Tab 1 qRT-PCR primer

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17及Treg細(xì)胞水平：采用Ficoll分離液分離并獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)/ml。分別加入100 ng/ml佛波酯、1 μg/ml離子霉素混勻，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，后加入1 μl/ml莫能霉素繼續(xù)培養(yǎng)5 h。將細(xì)胞分為2份，分別加入相應(yīng)單抗，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞水平及Th17細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)，用winMDI 2.9進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Th17水平用CD4+IL-17+在CD4+T細(xì)胞中百分比表示，Treg細(xì)胞水平用CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中百分比表示。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平：采用ELISA法檢測(cè)入組者血清白介素17(interleukin 17, IL-17)、IL-10、IL-23、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β, TGF-β)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平比較如表2所示，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組(P均<0.05)。

表2 各組外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平比較 Tab 2 Comparison of expressions of miR-21 and miR-155 in peripheral blood of each group

注：與健康對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 各組Th17、Treg細(xì)胞水平比較自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg比值及Th17 MFI值均明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(見(jiàn)表3和圖1、圖2)。

組別例數(shù)Th17細(xì)胞/% Treg細(xì)胞/% Th17/TregTh17 MFI自身免疫性肝炎組590.83±0.29*5.46±2.75*0.16±0.03*357.62±105.49*原發(fā)性膽汁性肝硬化組630.79±0.24*5.31±2.27*0.15±0.02*319.17±104.61*健康對(duì)照組610.46±0.133.54±1.150.13±0.03167.58±53.24

注：與健康對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖1 Th17流式細(xì)胞檢測(cè)圖(Q2區(qū)為Th17細(xì)胞所在區(qū)域)；圖2 Treg流式細(xì)胞檢測(cè)圖(Q2區(qū)為Treg細(xì)胞所在區(qū)域) Fig 1 Th17 flow cytometry (Q2 was the region where Th17 cells were located); Fig 2 Treg flow cytometry (Q2 was the area where Treg cells were located)

2.3 各組血清中Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較如表4所示，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者血清IL-10、IL-17、IL-23及IL-6水平均顯著高于健康對(duì)照組(P均<0.05)，TGF-β水平均顯著低于健康對(duì)照組(P均<0.05)。

注：與健康對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.4 自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平與Th17/Treg相關(guān)性自身免疫性肝炎組患者血清miR-21表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平呈正相關(guān)(r=0.421，P=0.001)，miR-155表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平呈正相關(guān)(r=0.453，P=0.000)。原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者血清miR-21表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平呈正相關(guān)(r=0.554，P=0.000)，miR-155表達(dá)水平與外周血Th17/Treg水平呈正相關(guān)(r=0.473，P=0.000)(見(jiàn)圖3～圖6)。

2.5 自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平與細(xì)胞因子相關(guān)性如表5所示，自身免疫性肝炎組患者外周血miR-21表達(dá)水平與IL-10、IL-17、IL-23呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)；miR-155表達(dá)水平與IL-10、IL-17、IL-6呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21表達(dá)水平與IL-10、IL-17、IL-6呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)；miR-155表達(dá)水平與IL-17、IL-23呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。

圖3 自身免疫性肝炎組患者血清miR-21與Th17/Treg水平相關(guān)性；圖4 自身免疫性肝炎組患者血清miR-155與Th17/Treg水平相關(guān)性；圖5 原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者血清miR-21與Th17/Treg水平相關(guān)性；圖6 原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者血清miR-155與Th17/Treg水平相關(guān)性

Fig 3 Correlation between serum miR-21 and Th17/Treg in patients with autoimmune hepatitis; Fig 4 Correlation between serum miR-155 and Th17/Treg in patients with autoimmune hepatitis; Fig 5 Correlation between serum miR-21 and Th17/Tregin patients with primary biliary cirrhosis; Fig 6 Correlation between serum miR-155 and Th17/Treg in patients with primarybiliary cirrhosis

表5 自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)與細(xì)胞因子相關(guān)性分析Tab 5 The correlation of the expressions of miR-21, miR-155 with cytokines in peripheral blood of patients with autoimmune hepatitis and primary biliary cirrhosis

3 討論

自身免疫性肝病患者前期總體表現(xiàn)為食欲下降、乏力、肝區(qū)不適、黃疸等，不同類型疾病也具有典型癥狀。自身免疫性肝炎以肝細(xì)胞病變?yōu)橹?，特征是血清轉(zhuǎn)氨酶、免疫球蛋白水平升高；原發(fā)性膽汁性肝硬化以小葉間膽管和小膽管病變?yōu)橹?，特征是膽?nèi)淤膽、總膽紅素升高等；原發(fā)性硬化性膽管炎以肝內(nèi)大膽管病變?yōu)橹?，與原發(fā)性膽汁性肝硬化患者臨床癥狀相似，需進(jìn)行造影區(qū)分[1]。由于癥狀不明顯，多數(shù)自身免疫性肝病患者就診時(shí)已進(jìn)展至肝硬化、肝衰竭或伴有潰瘍性結(jié)腸炎等其他并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生存及生活質(zhì)量。

微小RNA(micro RNA, miRNA)是一類能夠穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控功能的短鏈非編碼RNA，能夠參與疾病進(jìn)展。Nakagawa等[8]研究表明，miR-425在原發(fā)性膽汁性肝硬化中表達(dá)水平顯著下調(diào)，與疾病進(jìn)展有關(guān)，上調(diào)miR-425表達(dá)可能作為該疾病免疫治療策略。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎中miR-27a表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，可作為乙型肝炎發(fā)生發(fā)展預(yù)測(cè)因子。有研究[10]報(bào)道，原發(fā)性硬化性膽管炎中miR-200b表達(dá)上調(diào)，長(zhǎng)時(shí)間黑暗環(huán)境中下調(diào)miR-200b水平可降低肝纖維化。以上研究提示，miRNA在自身免疫性肝病及肝炎進(jìn)展中有重要作用。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著升高，提示miR-21、miR-155可能與自身免疫性肝病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，與疾病活動(dòng)性有關(guān)[11]。Hou等[12]研究證實(shí)，潰瘍性結(jié)腸炎中miR-155表達(dá)水平升高，與Th17及相關(guān)炎癥因子表達(dá)上調(diào)有關(guān)。提示miR-21和miR-155可能通過(guò)免疫或炎癥調(diào)控通路參與自身免疫性肝病進(jìn)展。

Th17細(xì)胞是一種能分泌IL-17的T細(xì)胞亞群，與IL-6、IL-23等促炎因子分泌水平密切相關(guān)，在免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。Tregs細(xì)胞是維持機(jī)體免疫平衡的重要因素之一，主要分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子。Feng等[13]研究表明，Th17/Tregs比值在自身免疫性肝病中表達(dá)水平明顯升高，且活動(dòng)期合并不良反應(yīng)患者及治療后好轉(zhuǎn)患者Th17/Tregs比值明顯高于緩解期合并不良反應(yīng)患者及治療后未好轉(zhuǎn)患者。本研究結(jié)果顯示，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例、Th17/Treg及Th17 MFI值均明顯高于健康對(duì)照組，與Feng等[13]研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者血清miR-21、miR-155表達(dá)水平均與外周血Th17/Treg水平呈正相關(guān)，提示miR-21、miR-155可能通過(guò)影響Th17/Treg水平參與自身免疫性肝病進(jìn)展。

Ganesan等[14]在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17可能通過(guò)調(diào)控STAT-3、IL-23等細(xì)胞因子表達(dá)參與疾病進(jìn)展。有研究報(bào)道，下調(diào)IL-6表達(dá)可減輕炎癥反應(yīng)，抑制潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展[15]。IL-10在狼瘡性腎炎患者血清中表達(dá)水平顯著升高，在疾病發(fā)展中有一定作用[16]。Wang等[17]研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎中促進(jìn)TGF-β表達(dá)可抑制結(jié)腸上皮炎癥。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者血清IL-10、IL-17、IL-23及IL-6水平均上調(diào)，TGF-β水平均下調(diào)，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡性腎炎、潰瘍性結(jié)腸炎中表達(dá)結(jié)果一致，提示IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β等細(xì)胞因子水平可能與自身免疫性肝病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性肝炎組患者外周血miR-21表達(dá)水平與IL-10、IL-17、IL-23呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)；miR-155表達(dá)水平與IL-10、IL-17、IL-6呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)。原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21表達(dá)水平與IL-10、IL-17、IL-6呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)；miR-155表達(dá)水平與IL-17、IL-23呈正相關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)。提示miR-21、miR-155可能通過(guò)影響Th17/Treg平衡，調(diào)控IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β等細(xì)胞因子水平，促進(jìn)自身免疫性肝病進(jìn)展。但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，與健康對(duì)照組相比，自身免疫性肝炎組和原發(fā)性膽汁性肝硬化組患者外周血miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著升高，與Th17/Treg比值及相關(guān)細(xì)胞因子水平變化有關(guān)，miR-21、miR-155可能通過(guò)影響Th17/Treg平衡，促進(jìn)自身免疫性肝病發(fā)生、發(fā)展。但由于本研究方法較為基礎(chǔ)，樣本量較少，具體作用機(jī)制尚需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。