朱曦鑒， 易 靖， 梁靜思， 朱維賢， 李燦輝， 唐 唯

(1.云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院， 昆明 650500； 2.云南省昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 昆明 650201)

馬鈴薯(南方多邊俗稱洋芋)為外來(lái)農(nóng)作物，在清代中期引入中國(guó)，云南最早在清道光年間有記載種植于昭通[1,2]。由于云南的地理氣候條件類(lèi)似于安第斯山脈的馬鈴薯起源地，幾百年來(lái)，這些外來(lái)品種對(duì)云南的政治、經(jīng)濟(jì)和文化傳播起到了深遠(yuǎn)的影響。云南省比較典型的地方品種有香格里拉地區(qū)的中甸紅，麗江地區(qū)的老鼠洋芋，大理的劍川紅和耗子洋芋，東川的“開(kāi)花洋芋”，曲靖的轉(zhuǎn)心烏，昭通的自來(lái)洋芋和紅馬欄，及文山的小紫洋芋[3,4]。其中“開(kāi)花洋芋”常年種植于昆明市東川區(qū)李子溝高寒山區(qū)，因缺乏準(zhǔn)確文字記載，具體引入年代已不可考證，但有東川年鑒記載“開(kāi)花洋芋”自20世紀(jì)70年代從昆明市祿勸縣轉(zhuǎn)龍鎮(zhèn)引進(jìn)種植，當(dāng)時(shí)稱“老家洋芋”[5]。該品種皮紅肉黃，蒸煮后像開(kāi)花的花瓣，肉色金黃，口感酥松香醇，一直受到省內(nèi)外馬鈴薯高端市場(chǎng)的歡迎，目前該品種已注冊(cè)品牌。

由于休眠期短，“開(kāi)花洋芋”僅種植于東川區(qū)李子溝高山峽谷地區(qū)，其獨(dú)特的地理?xiàng)l件有利于農(nóng)戶種植和種薯保存，因此近百年來(lái)該品種資源得以保存下來(lái)。但是，該品種不能在更大地域范圍內(nèi)開(kāi)發(fā)利用，薯型差且種薯在儲(chǔ)藏期容易發(fā)芽和出現(xiàn)薯塊黑斑，病毒病連年加重，退化較為嚴(yán)重，產(chǎn)量和抗病性均存在下降，進(jìn)入省外市場(chǎng)常常受阻。除此之外，品種混淆問(wèn)題也嚴(yán)重制約著“開(kāi)花洋芋”的推廣和大面積種植，且目前“開(kāi)花”原因和遺傳背景尚不清楚。據(jù)此，本研究以“開(kāi)花洋芋”為材料，采用植物學(xué)和農(nóng)藝性狀觀察，細(xì)胞質(zhì)遺傳特點(diǎn)和細(xì)胞核SSR多態(tài)性分析結(jié)合的方法，以東川區(qū)4個(gè)馬鈴薯主栽品種為對(duì)照，深入解析“開(kāi)花洋芋”的種質(zhì)資源特點(diǎn)，將對(duì)其生產(chǎn)、栽培管理和種質(zhì)資源利用及保存都具有深遠(yuǎn)意義，也有助于地方特色品種的開(kāi)發(fā)及邊遠(yuǎn)山區(qū)的扶貧攻堅(jiān)。

1 材料與方法

1.1 材 料

原產(chǎn)于東川的“開(kāi)花洋芋”，組培苗于2017年由昆明市農(nóng)科院提供。其它主栽品種大西洋、米拉、合作88和威芋3號(hào)為對(duì)照材料，組培苗由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院提供。

1.2 方 法

1.2.1植株性狀的觀察

原產(chǎn)地田間播種，待出苗整齊后，每隔10 d對(duì)株型，葉型，花型和花色進(jìn)行實(shí)地觀察記錄及拍照。

1.2.2染色體組的倍性檢測(cè)

四倍體馬鈴薯C 88為對(duì)照，樣品制備參照施春暉等，流式細(xì)胞儀鑒定獼猴桃倍性技術(shù)研究[6]。流式細(xì)胞儀FACSVerse(美國(guó)Becton Dinckinson公司)，按照儀器操作流程對(duì)“開(kāi)花洋芋”染色體組倍性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3細(xì)胞質(zhì)DNA標(biāo)記檢測(cè)

馬鈴薯葉片總基因組的提取，利用植物基因組提取試劑盒(DP 320，Tiangen， 北京)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，稀釋到50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存。

利用4對(duì)馬鈴薯葉綠體DNA(cpDNA)多態(tài)性標(biāo)記及2對(duì)馬鈴薯線粒體DNA(mtDNA)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)鑒定材料和對(duì)照材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，引物信息及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1，可將待測(cè)馬鈴薯細(xì)胞質(zhì)劃分成T型(四倍體普通栽培型S.tuberosumssp.tuberosum)、W型(野生型)、D型(來(lái)源于六倍體S.demissum的野生馬鈴薯類(lèi)群)、A型(安第斯栽培類(lèi)型S.tuberosumssp.andigena)。

PCR擴(kuò)增體系為：模板DNA 50 ng，10×Taq buffer 2.5μL，正反向引物各10μM，dNTPs (2.5 mM each)2.0μL，Taq DNA聚合酶(天根生物科技有限公司)2 U，補(bǔ)ddH2O至終體積25μL。按照引物原文獻(xiàn)條件設(shè)置PCR程序。PCR后用130 V，400 mA，2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，記錄各帶型。

表1 引物信息

引物名稱退火溫度/℃擴(kuò)增位點(diǎn)標(biāo)記類(lèi)型T[7]60ndhC/trnVSCARS[8]60rps16/trnQSSRSAC[9]601/11aCAPS(BamHI)D[10]60Band1SCARA[8]6010CAPS(BamHI)ALM4/5[11]57cob,rps10SCAR

注：表中T、S、A和SAC為葉綠體標(biāo)記；D和ALM 4/5為線粒體標(biāo)記，引物序列參照原文獻(xiàn)。

1.2.4細(xì)胞核SSR標(biāo)記檢測(cè)

利用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 28660-2012《馬鈴薯種薯真實(shí)性和純度鑒定SSR分子標(biāo)記》所列的12對(duì)核基因組SSR引物(表2)，對(duì)待鑒定樣品和對(duì)照樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測(cè)，擴(kuò)增條件參照GB/T 28660-2012，毛細(xì)管電泳檢測(cè)參照唐唯等[12]的方法進(jìn)行。

表2 所用SSR引物的信息

注：引物序列參照GB/T28660-2012 (馬鈴薯種薯真實(shí)性和純度鑒定 SSR分子標(biāo)記)。

將12對(duì)SSR引物的所有片段分子量從小到大排列，按照引物順序，鑒定材料和對(duì)照品種逐個(gè)對(duì)多態(tài)性條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同位置，有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，組成1和0的矩陣表，此即為品種的DNA指紋圖譜。采用Nei和Li提出的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)：GS=2 Nij/(Ni+Nj)，其中Ni為第i個(gè)品種的擴(kuò)增條帶數(shù)目，Nj為第j個(gè)品種的擴(kuò)增片段數(shù)目，Nij為第ij個(gè)品種間共有的帶譜數(shù)目。用MVSP Ver 3.1軟件以GS值，非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)，繪制樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物學(xué)特征與農(nóng)藝性狀的觀察

原產(chǎn)地調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“開(kāi)花洋芋”僅在東川區(qū)李子溝幾個(gè)自然村種植。李子溝平均海拔2 600 m，為高山峽谷地貌，晝夜溫差大(圖1 a)。

注：a為生長(zhǎng)環(huán)境；b為葉形；c為花色；d為薯形；e為蒸煮后狀態(tài)。

植物學(xué)特征：“開(kāi)花洋芋”生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，田間植株高大直立，生長(zhǎng)旺盛；復(fù)葉較小，小葉分布緊湊，頂葉較小，葉片皺縮，復(fù)葉與莖桿著生成銳角、半直立生長(zhǎng)；開(kāi)花繁茂，星狀花冠，花紫色或紫紅色，花藥小而整齊，花梗直立。具有野生種的形態(tài)特征(圖1 b，圖1 c)。

農(nóng)藝學(xué)性狀：薯塊頂芽凹陷，芽眼深，薯型為球形或者扁球形，紅皮黃肉，蒸煮后表皮開(kāi)裂脫落類(lèi)似開(kāi)花狀，薯塊休眠期短，蒸煮品質(zhì)佳、淀粉顆粒大，口感酥、洋芋風(fēng)味濃(圖1 d，圖1 e)。

2.2 馬鈴薯線粒體和葉綠體基因組分子標(biāo)記檢測(cè)

利用6對(duì)馬鈴薯細(xì)胞質(zhì)基因組標(biāo)記對(duì)待測(cè)馬鈴薯DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“開(kāi)花洋芋”樣本的細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型為W/α[D]型。W/α細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型主要來(lái)自野生種，D型細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型則僅為六倍體馬鈴薯野生種(S.demissum)及其祖先二倍體野生種(S.verrecosum)所有。對(duì)照材料大西洋、米拉和威芋3號(hào)的細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型均為T(mén)/β，是四倍體普通栽培種典型的細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型；對(duì)照合作88細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型為W/α[D]，是公認(rèn)的具有野生種血緣的安第斯栽培類(lèi)型品種。

注：a為S標(biāo)記；b為T(mén)標(biāo)記；c為D標(biāo)記；d為AML 4/5標(biāo)記；e為SAC標(biāo)記；f為A標(biāo)記；K為“開(kāi)花洋芋”WY-3(威芋3號(hào))；M為米拉C 88(合作88 DXY:大西洋)。

2.3 染色體組倍性檢測(cè)結(jié)果

以已知四倍體C 88染色體為對(duì)照的倍性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“開(kāi)花洋芋”染色體為四倍體(圖3 b)。

注：a為C 88；b為“開(kāi)花洋芋”。

2.4 細(xì)胞核基因組的SSR標(biāo)記檢測(cè)和聚類(lèi)分析結(jié)果

對(duì)“開(kāi)花洋芋”馬鈴薯樣本和4個(gè)對(duì)照材料，依次將STM 0019 a、STM 0030、STM 0037、STM 1049、STM 1053、STM 1104、STM 1106、STM 2013、STM 2022、STM 3012、STM 3032 a、STpoAc 58引物擴(kuò)增的所有片段從小到大排列，各位點(diǎn)存在的片段用1表示，不存在的片段用0表示，建立了5個(gè)品種的DNA 分子指紋庫(kù)圖譜(表3)。

表3 細(xì)胞核基因組DNA分子指紋圖譜

品種DNA指紋圖譜開(kāi)花洋芋000010001001101001010111001101010101101010111110111大西洋000010100100111100111011011011110000111011001000100米拉101110001011001001111111111011011001101110111100011威芋3號(hào)011011001001101000011011001011110000101011011010111合作88001010010001101010111111001111110011101010011001110

利用MVSP Ver 3.1軟件進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，對(duì)送檢“開(kāi)花洋芋”馬鈴薯樣本和4個(gè)對(duì)照材料SSR擴(kuò)增片段進(jìn)行親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，在遺傳相似性系數(shù)為0.742時(shí)，可以把5個(gè)品種完全分開(kāi)，“開(kāi)花洋芋”和米拉親緣關(guān)系最近，與大西洋親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4，表4)。

圖4 12對(duì)引物對(duì)5個(gè)馬鈴薯品種的聚類(lèi)分析

表4 “開(kāi)花洋芋”和4個(gè)主栽品種親緣關(guān)系分析

品種遺傳相似性系數(shù)大西洋米拉威芋3號(hào)合作88開(kāi)花洋芋0.5380.7410.7330.714

利用12對(duì)SSR引物對(duì)“開(kāi)花洋芋”、大西洋、米拉、威芋3號(hào)、合作88的多態(tài)性的檢測(cè)獲得了“開(kāi)花洋芋”的分子指紋圖譜。聚類(lèi)分析結(jié)果(表4)表明，“開(kāi)花洋芋”與對(duì)照主栽品種的遺傳相似性系數(shù)均較低，為明顯不同的品種資源。

3 討 論

在分子標(biāo)記技術(shù)廣泛用于種質(zhì)資源鑒定前，馬鈴薯品種鑒定主要通過(guò)其形態(tài)學(xué)特征和農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行，該方法可較為準(zhǔn)確的把不同品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，但該方法容易受到環(huán)境條件和個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，具有不確定性。因此，本研究首先利用細(xì)胞質(zhì)基因組DNA多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行鑒定。由于胞質(zhì)細(xì)胞器具有母系遺傳的特點(diǎn)，因此可認(rèn)為即使是在雜交多代后，仍然可用于追述植物母本的最佳手段[9]。本研究利用6個(gè)細(xì)胞質(zhì)DNA多態(tài)性標(biāo)記，確定“開(kāi)花洋芋”是具有W/α[D]型細(xì)胞質(zhì)的野生型品種。W型為1922—1925年由德國(guó)選育，1948年美國(guó)人利用W型材料育出了著名品種康奈拜克。據(jù)此，具有野生型血緣關(guān)系的品種“開(kāi)花洋芋”品種，應(yīng)該也存在了近百年。有研究報(bào)道稱，蒸煮“開(kāi)花”、薯塊顏色鮮艷、休眠期短等特色農(nóng)藝性狀為二倍體種(S.phureja)特有[13-14]，S.phureja常用作改善優(yōu)良性狀的雜交親本材料外，還能孤雌生殖誘發(fā)四倍體栽培種產(chǎn)生雙單倍體[15]。本實(shí)驗(yàn)中有2個(gè)證據(jù)不支持“開(kāi)花洋芋”和S.phureja有明顯血緣關(guān)系，第一是染色體倍性，“開(kāi)花洋芋”為四倍體而S.phureja為二倍體；第二是線粒體多態(tài)性標(biāo)記，“開(kāi)花洋芋”為D型而S.phureja為P型。D型均為含有(S.demissum)六倍體野生種細(xì)胞質(zhì)基因組的野生型栽培品種。S.demissum起源于墨西哥，20世紀(jì)20年代開(kāi)始引入德國(guó)作為育種材料引入到四倍體栽培種中，在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，云南省西北部一些地方品種中含有此細(xì)胞質(zhì)多態(tài)類(lèi)型，例如木嘎洋芋，老鼠洋芋和大灣洋芋[2]。Lossl A等[16]和Ducreux L J M等[17]研究表明，具有α類(lèi)型線粒體多倍型的薯塊中淀粉含量較高，因此在蒸煮中容易“開(kāi)花”。本研究已證實(shí)東川“開(kāi)花洋芋”為四倍體型，但倍性和蒸煮開(kāi)花之間的關(guān)系有待進(jìn)一步解析。

為了避免在形態(tài)學(xué)和農(nóng)藝學(xué)性狀觀察上的誤差，在確定細(xì)胞質(zhì)多態(tài)性類(lèi)型的前提下，本研究進(jìn)一步在細(xì)胞核水平，利用馬鈴薯種薯鑒定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中所用的12對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)“開(kāi)花洋芋”和東川區(qū)其它幾個(gè)有代表性的主栽品種進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析并建立了DNA分子指紋，結(jié)果表明，“開(kāi)花洋芋”在DNA水平上是顯著不同于其它幾個(gè)品種，在已發(fā)表的關(guān)于云南省地方馬鈴薯的DNA指紋庫(kù)的文獻(xiàn)中，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有相同的品種[18]。

因此，基于細(xì)胞質(zhì)多態(tài)性特點(diǎn)、細(xì)胞核遺傳分析、蒸煮風(fēng)味和“開(kāi)花”特性認(rèn)為，“開(kāi)花洋芋”是1個(gè)典型的馬鈴薯地方特色品種。本研究可為“開(kāi)花洋芋”種質(zhì)資源保護(hù)利用、地方品種種質(zhì)資源鑒定以及分子標(biāo)記輔助設(shè)計(jì)育種提供理論支持。