夏 凡， 代婷婷， 姚新轉(zhuǎn)， 呂立堂,

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室， 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院， 貴陽 550025)

重金屬鎘的污染在我國非常嚴(yán)重，它能造成植物生長系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致農(nóng)作物大量減產(chǎn)甚至死亡[1]。隨著基因工程的發(fā)展，挖掘抗逆相關(guān)基因能夠減輕逆境危害，有助于深入地闡釋植物在不良環(huán)境中的抗逆機制，也為作物的抗逆性分子育種提供基礎(chǔ)。12-氧-植物二烯酸還原酶( 12-oxo-phytodienoic acid reductase，OPR) 是茉莉酸生物合成途徑的關(guān)鍵性酶，茉莉酸類的化合物( jasmonic acids,JA)也在植物生長過程中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。茉莉酸在植物體內(nèi)作為一種內(nèi)源信號分子，當(dāng)植物體受到傷害的時候，未受傷害的部位可以通過它讓植物進入警戒狀態(tài)，以此來抵御致病菌和昆蟲的危害[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸化合物參與非生物脅迫的反應(yīng)，如低溫[4]。OPR基因的功能已經(jīng)在玉米[5]、番茄[6-7]、水稻[8]和豌豆[9]中得到驗證，但關(guān)于水稻OPR基因抗鎘研究目前還未見報告。本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選用模式植物煙草(Nicotianatabacum)，將克隆得到的OPR基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法遺傳轉(zhuǎn)化到煙草植株體內(nèi)，應(yīng)用實時熒光定量PCR，對重金屬(CdCl2)處理條件下的OPR基因表達(dá)情況及相關(guān)基因進行分析，為非生物脅迫分子機制的研究提供理論基礎(chǔ)，為作物在抗逆境脅迫及抗重金屬污染提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

煙草(NicotianatabacumL. Xanthin)種子由T 1代煙草植株獲得，PCR引物由上海英捷生物技術(shù)有限公司合成；其它相關(guān)試劑采購于天津富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 基因克隆與載體構(gòu)建

利用報道的水稻中的OPR基因，在GenBank數(shù)據(jù)庫中BlastP搜素，得到同源基因的cDNA序列及氨基酸。根據(jù)得到的cDNA序列設(shè)計并合成引物，基因克隆和載體構(gòu)建參考鄒冰杰等[10]的方法。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定

采用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草[11]。以野生型煙草植株葉片為外植體，0.1%升汞消毒后進行遺傳轉(zhuǎn)化，4周后愈傷組織長出，進行繼代培養(yǎng)獲得抗性芽，抗性芽長至2～3 cm，然后將抗性芽切下，置于生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。2周后待無菌苗長至4～7 cm，煉苗2 d后移栽到花盆中。從煙草葉片中提取基因組DNA，利用根據(jù)OPR序列設(shè)計檢測引物OPRP 1：5’-CCTCTTCTTCCACGACTGCT-3’；P 2：5’-TCGTCAGCACCTTCTTCTCC-3’，PCR反應(yīng)體系(表1)及反應(yīng)條件(表2)。

注：RB為T-DNA右邊界；35 S為CaMV；tNOS為終止子；LB為T-DNA左邊界。

待反應(yīng)完畢后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測結(jié)果。

表1 PCR反應(yīng)體系

試劑體積/ μL基因組DNA2.0ddH2O6.4正向引物(10μM)0.8反向引物(10μM)0.8 Premix Ex Taq10.0

表2 PCR反應(yīng)條件

溫度/℃時間/s循環(huán)/次95300198105530357220723004∞1

1.4 實時熒光定量PCR

用300μmol·L-1CdCl2溶液脅迫處理前脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的葉cDNA為模板。參考OPR基因序列，設(shè)計基因的RT-PCR擴增引物，實時定量分析基因的相對表達(dá)量。引物設(shè)計序列為：F 5′CATGCTCAGTGCCATCAAAG-3′；R 5′CCCAATGAGCAGGAAGAAATG-3′。以煙草Actin基因作內(nèi)參對照(F：5′TGGTTAAGGCTGGATTTGCT-3′；R：5′TGCATCCTTTGACCCATAC-3′)， 在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到已報道的煙草抗鎘相關(guān)基因Snakin-2(Genebank:XM_009623044.2，F(xiàn)：5′TCTCCTTGCTCCTCCTCGAT-3′；R：5′TCAGTGTTGCCAGAAGTGCC-3′)和GRP-2(Genebank:NM_001311181.1F：5′TGGACAGAGGGCTAAGGGAA-3′；R：5′TCAGGGCCGGTAACATCAAC-3′)，設(shè)計各基因的RT-PCR擴增引物并設(shè)計Real-time PCR的反應(yīng)體系(表3)及反應(yīng)條件(表4)。

表3 Real-time PCR反應(yīng)體系

試劑體積/μL2×Power SYBR Green PCR Master Mix 10.0正向引物(10μM)1.0反向引物(10μM)1.0cDNA2.0ddH2O up to20.0

表4 Real-time PCR反應(yīng)條件

溫度/℃時間/s循環(huán)/次95600 95151606040

1.5 脅迫處理

用CdCl2溶液(300μmol·L-1)模擬重金屬污染。30 d后，選擇長勢相似的轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過鑒定呈陽性的植株為試驗材料，用CdCl2(300μmol·L-1)溶液脅迫處理，15 d后拍照并剪取葉片，做好標(biāo)記保存于-80 ℃冰箱中待用。選取T 1代轉(zhuǎn)基因株系(TP 7、TP 8、TP 12)和WT植株的種子為材料，放入含有3個濃度梯度的(0、150、300μmol·L-1)CdCl2溶液的濾紙上萌發(fā)進行鎘脅迫分析實驗(濾紙和空皿提前高壓滅菌)，分別在第0、5、10天和第15天統(tǒng)計種子發(fā)芽率，設(shè)置4個重復(fù)。

1.6 植物生理生化指標(biāo)的測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量都是使用實驗室酶標(biāo)儀來測定。實驗選取生長狀況基本一致，選取處理前(-80 ℃冰箱保存)和處理后的株系，稱取約0.1 g葉片用液氮研磨均勻，加入提取液，酶活測定方法參考蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒說明書的實驗步驟，進行植物生理生化指標(biāo)的測定。試驗3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.7 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所有的數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各平均值差異性的統(tǒng)計學(xué)分析是利用SPSS 22.0軟件包分析完成。

2 結(jié)果分析

2.1 種子的抗鎘性分析

挑選飽滿的野生型和3株轉(zhuǎn)基因煙草(TP 7、TP 8和TP 12)的種子各50顆，放入含有3個濃度(0、150、300μmol·L-1)梯度的CdCl2溶液的濾紙上萌發(fā)進行鎘脅迫(濾紙和空皿提前高壓滅菌)，分別在不同時間段(0 d、5 d、10 d、15 d)統(tǒng)計種子的發(fā)芽率。當(dāng)Cd2+濃度在300μmol·L-1時，轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率極顯著(p<0.01)高于野生型，15 d時，轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率在65%左右，而野生型煙草種子發(fā)芽率不到20%。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的種子在含有CdCl2溶液的處理下，表現(xiàn)出了一定的抗鎘性(圖2)。

注：“*”和“**”分別表示所測定項目在轉(zhuǎn)基因與野生型植株之間差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)；WT為野生型(wild type)；TP 7～TP 12為轉(zhuǎn)基因株系(Transgenic lines)；A、B濃度為0；C、D濃度為150 μmol·L-1；E、F濃度為300 μmol·L-1。

2.2 轉(zhuǎn)OPR基因?qū)煵葜仓晟砩笜?biāo)的影響

在自然條件下，選擇生長30 d狀況基本一致的煙草植株，用300μmol·L-1CdCl2溶液模擬重金屬澆灌， 處理時間為15 d，然后取樣品進行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定。

在300μmol·L-1CdCl2溶液脅迫處理下，時間為15 d時(圖5)，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的SOD酶活性和POD酶活性都上升，轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活性和POD酶活性都明顯高于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株的SOD和POD酶活性分別為277.5 U·g-1和328U·g-1，而野生型植株的SOD和POD酶活性分別為169.9 U·g-1和195.0 U·g-1，與野生型植株差異達(dá)顯著水平；轉(zhuǎn)基因植物CAT酶的活性增加，比野生型CAT活性增加了57%；野生型植株在處理15 d時MDA含量迅速升高，轉(zhuǎn)基因植株MDA含量升高相對于比較緩慢。

圖3 Cd2+脅迫轉(zhuǎn)基因和野生型煙草

圖4 Cd2+脅迫下轉(zhuǎn)基因株系和野生型煙草SOD、POD、CAT活性和MDA含量

2.3 轉(zhuǎn)OPR基因煙草相關(guān)表達(dá)基因的影響

實時熒光定量表達(dá)分析，在正常條件下，轉(zhuǎn)OPR基因表達(dá)以及抗鎘相關(guān)基因Snakin-2和GRP-2表達(dá)整體水平相似；脅迫15 d，轉(zhuǎn)OPR基因在煙草中的平均表達(dá)量平均是野生型的2.48倍；Snakin-2基因的平均表達(dá)量是野生型的1.70倍；GRP-2基因的平均表達(dá)量是野生型的1.45倍(圖5)。結(jié)果表明，Cd2+脅迫轉(zhuǎn)OPR基因植株可以顯著誘導(dǎo)煙草中Snakin-2和GRP-2基因的上調(diào)。說明該基因可能參與鎘脅迫的滲透調(diào)節(jié)過程來提高植物抗鎘性。

圖5 轉(zhuǎn)OPR基因煙草相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

OPR基因在植物調(diào)控耐受性方面具有重要作用[12-14]。本研究從水稻中克隆獲得了OPR基因，研究其在作物抗重金屬的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPR基因能夠?qū)dCl2脅迫作出應(yīng)答，OPR基因及煙草抗鎘相關(guān)基因Snakin-2和GRP-2對Cd2+處理后，OPR、Snakin-2和GRP-2基因均表達(dá)上調(diào)。煙草中Snakin-2和GRP-2基因均對Cd2+有一定的耐受性使其基因表達(dá)上調(diào)[15]與該實驗結(jié)果趨勢基本一致。在Cd2+濃度為300μmol·L-1脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株種子發(fā)芽率顯著高于野生型，說明轉(zhuǎn)OPR基因植株在重金屬脅迫過程中表現(xiàn)出較強的抗鎘能力。重金屬脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(如超氧陰離子、過氧化氫等)，過多的積累導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性變大，當(dāng)超出了植株可耐的范圍，植物將受害甚至導(dǎo)致死亡[16]。重金屬脅迫導(dǎo)致植株組織的氧化脅迫和膜損傷，改變酶系活性，對植株生長產(chǎn)生一定的影響。植物通過抗氧化酶系統(tǒng)來提高植株的耐抗性[17]。大量研究表明，重金屬Cd2+在一定濃度梯度范圍內(nèi)的脅迫能誘導(dǎo)植物SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性的增加，從而及時清理掉體內(nèi)產(chǎn)生的多余活性氧，維持植物的正常機能，當(dāng)重金屬濃度超過了植株可承受的最大范圍就有可能使植物失去維持活性氧平衡的能力[18-19]。研究表明，在不同濃度梯度鎘離子的脅迫處理下，測得轉(zhuǎn)基因植株的SOD和POD的酶活性都顯著高于野生型植株，而轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量雖然有所增加，卻低于野生型植株，說明轉(zhuǎn)OPR基因可以清除活性氧和改善膜脂過氧化，并減輕逆境對煙草植株的傷害。