姚 堯 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高度傳染性腸道疾病，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水、哺乳仔豬高病死率為主要特征[1]。1978年，比利時首次分離鑒定出該病毒，命名為 CV777[2]。

近年來，豬流行性腹瀉的流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大，PED的暴發(fā)給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉診斷技術(shù)、診斷試劑以及疫苗等是該病防治的關(guān)鍵[3]。按照新獸藥相關(guān)規(guī)定，該病活疫苗鑒別、效力、外源病毒等項目的檢驗和病毒篩查需要豬流行性腹瀉病毒陽性血清。但是目前國內(nèi)缺乏質(zhì)量穩(wěn)定的豬流行性腹瀉病毒陽性血清。本研究通過用豬流行性腹瀉病毒對試驗用兔進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，再用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗對試驗用兔進(jìn)行3～5次免疫，而后無菌采集兔血清，經(jīng)過檢驗、分裝、凍干等工藝過程，并最終用于鑒別、效力、外源病毒等項目的檢驗和病毒篩查過程，不但能大大降低因用豬作為試驗動物的制造高成本，同時也減小了因用豬制備陽性血清而引起的同源動物其他外源病毒污染的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 110日齡兔，購于福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗場。

1.1.2 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）ZJ08株檢測用抗原 由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，效價107.6TCID50/mL，批號為 BS2018005。

1.1.2 免疫用豬流行性腹瀉病毒 （ZJ08株） 由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號為DZ20180705。

1.1.3 免疫用豬流行性腹瀉病毒（ZJ08株）滅活疫苗 由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號為SY2018001。

1.2 方法

1.2.1 動物篩選 從福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗場采購的10只110日齡兔，按表1方法檢測相關(guān)抗體。

表1 病原及抗體檢驗方法

1.2.2 免疫程序 用表1方法確定10只兔抗體均為陰性后，按表2對兔進(jìn)行免疫。

1.2.3 血清的采集與分離 最后一次免疫后每10 d監(jiān)測免疫后抗體水平的變化情況。當(dāng)抗體水平滿足要求時，采用無菌心臟采血法取血，1 500 r/min離心10 min，分離血清。

1.2.4 分裝凍干 將混合均勻的血清在無菌條件下定量分裝至安剖瓶中，凍干后抽真空封口。

1.2.5 血清的檢驗 物理性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、外源檢驗、真空度測定和剩余水分測定，按《中國獸藥典》方法進(jìn)行檢測[4]。部分項目按表1方法進(jìn)行檢驗。

1.2.5.1 中和抗體效價測定 將血清56℃滅活30 min后2倍系列稀釋，選取適宜稀釋度與豬流行性腹瀉病毒ZJ08株200 TCID50/mL的病毒液等量混合，37℃下作用60 min后，每個稀釋度接種長滿Vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，每孔0.1 mL。同時設(shè)病毒對照6孔，陰性對照6孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，按照Reed-Muench方法計算血清的中和抗體效價。

1.2.5.2 特異性檢驗 將豬流行性腹瀉病毒（ZJ08株）工作抗原稀釋成200 TCID50/mL，與等量的豬流行性腹瀉病毒陽性血清混合，置37℃中和1 h，接種長滿Vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，100 uL/孔，即為中和組。同時設(shè)接種病毒的陽性對照6孔和接種健康細(xì)胞的陰性對照6孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察細(xì)胞病變。

1.2.5.3 細(xì)菌內(nèi)毒素測定 按《中國獸藥典》方法進(jìn)行檢測[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物篩選結(jié)果 10只兔按表1方法確定抗體均為陰性后，再按表2進(jìn)行免疫后，隨機抽取4只兔進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)血清中豬流行性腹瀉病毒抗體效價隨時間呈遞增趨勢，結(jié)果見表3。

表3 豬流行性腹瀉病毒抗體水平監(jiān)測結(jié)果

根據(jù)檢測結(jié)果顯示，最后一次免疫后30 d，隨機抽取血清的中和抗體效價均在1：256以上，可以收獲全部血清。

2.2 血清的檢驗結(jié)果

2.2.1 物理性狀檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗和真空度測定 隨機選取5支凍干血清，分別進(jìn)行物理性狀檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗和真空度測定[4]，結(jié)果均無菌生長、無支原體生長、無外源病毒污染，且物理性狀和真空度檢驗均合格。

2.2.2 剩余水分測定 按文獻(xiàn) [4]方法進(jìn)行測定，4份樣品的剩余水分含量為 1.2%、1.3%、1.5%、1.1%，均小于4.0%，檢驗合格。

2.2.3 中和效價測定 隨機抽取8支凍干血清，復(fù)溶后 56 ℃滅活 30 min，2 倍系列稀釋至 1：64、1：128、1：256、1：512 后，接種長勢良好的單層 Vero 細(xì)胞，測定中和抗體效價。結(jié)果見表4。

2.2.4 特異性檢驗 中和組、陰性對照組均不出現(xiàn)細(xì)胞病變，病毒對照組出現(xiàn)病變，檢驗合格。

表2 豬流行性腹瀉病毒陽性血清免疫程序

2.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素測定 每毫升血清的內(nèi)毒素含量＜10EU。

表4 8支凍干陽性血清中和效價測定結(jié)果

3 討 論

本研究旨在為豬流行性腹瀉診斷技術(shù)、診斷試劑以及疫苗質(zhì)量監(jiān)控提供滿足要求的豬流行性腹瀉病毒陽性血清，這要求陽性血清應(yīng)具有良好的特異性和足夠高的中和效價。本研究以兔作為免疫動物，最終獲得了中和抗體效價大于1：256的豬流行性腹瀉病毒陽性血清（高于新獸藥標(biāo)準(zhǔn)4倍），可滿足于新獸藥中豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒活疫苗（HB08株+ZJ08株）的效力檢驗、鑒別檢驗和外源病毒檢驗。同時，用兔代替豬作為免疫動物，既降低了檢驗成本，又避免了因用同源動物制備陽性血清而引發(fā)的其他外源病毒污染的風(fēng)險，適合大規(guī)模制備。