張小蘭 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

PK15細(xì)胞為豬腎上皮細(xì)胞，父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細(xì)胞PK-2a，被ATCC 收藏（CCL-33）[1]。PK15 細(xì)胞對豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒等多種病毒比較敏感，已廣泛應(yīng)用于獸用疫苗的研究和生產(chǎn)[2]。隨著疫苗工藝研發(fā)的不斷創(chuàng)新，生物反應(yīng)器因有其自身的優(yōu)勢如可以穩(wěn)定控制培養(yǎng)條件、高密度培養(yǎng)、規(guī)?；a(chǎn)等被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)領(lǐng)域。然而，一般種子的擴(kuò)增也需要從方瓶培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)再到反應(yīng)器培養(yǎng)的過程。本文探討了PK15細(xì)胞在方瓶、轉(zhuǎn)瓶、生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長情況，為制定優(yōu)化的培養(yǎng)策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)基

1.1.1 細(xì)胞 PK15細(xì)胞株，由大北農(nóng)集團(tuán)北京動物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2.1 培養(yǎng)基 MEM購自gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 方瓶培養(yǎng) 復(fù)蘇一支PK15細(xì)胞至T75方瓶中培養(yǎng)，傳3代至細(xì)胞密度穩(wěn)定后，按細(xì)胞最佳傳代比例分種至3個T75方瓶中培養(yǎng)。待培養(yǎng)72 h，細(xì)胞剛好長滿單層且狀態(tài)良好時，3瓶T75方瓶細(xì)胞分別按正常方式消化傳代，即棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱處理的PBS清洗細(xì)胞2遍，每遍25 mL，再用0.25%胰酶4 mL消化細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)圓縮分離時棄去消化液，加6 mL含5%血清的營養(yǎng)液終止消化并進(jìn)行吹打細(xì)胞。每瓶細(xì)胞消化后分別取1 mL細(xì)胞懸液至EP管中待計數(shù)，其余細(xì)胞懸液按比例1：15分種至T75方瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液總量為25 mL，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。 每隔 24 h、48 h、72 h 觀察每瓶細(xì)胞狀態(tài)并記錄結(jié)果。每瓶細(xì)胞連續(xù)消化傳代3次，每次傳代比例為1：15，每次取消化后的細(xì)胞懸液計數(shù)，收集每次的細(xì)胞分種密度、培養(yǎng)72 h細(xì)胞密度、細(xì)胞增長倍數(shù)和觀察細(xì)胞24 h、48 h、72 h的生長狀態(tài)。

1.2.2 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 同上述方瓶培養(yǎng)，來自同一支復(fù)蘇細(xì)胞，逐漸按一定的比例擴(kuò)增至15 L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)2代密度穩(wěn)定后，按最佳分種密度分種至3個15 L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)。待培養(yǎng)72 h細(xì)胞長滿致密單層且狀態(tài)良好時，3瓶細(xì)胞分別按正常方式消化傳代，即棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱處理的PBS清洗細(xì)胞2遍，每遍200 mL，再用 0.25%胰酶100 mL消化細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)霧層時棄去消化液，加500 mL含5%血清的營養(yǎng)液終止消化。每瓶細(xì)胞消化后分別取1 mL細(xì)胞懸液至EP管中待計數(shù)，其余細(xì)胞懸液按比例1：8分種至15 L細(xì)胞瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液總量為1 500 mL，培養(yǎng)條件為12 r/min、37℃溫室。 每隔 24 h、48 h、72 h觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄結(jié)果。每瓶細(xì)胞連續(xù)消化傳代3次，每次傳代比例為1：8，每次取消化后的細(xì)胞懸液計數(shù)，收集每次的細(xì)胞分種密度、培養(yǎng)72 h細(xì)胞密度、細(xì)胞增長倍數(shù)和觀察細(xì)胞24 h、48 h、72 h的生長狀態(tài)。

1.2.3 生物反應(yīng)器培養(yǎng) 同上述方瓶、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，來源于同一支復(fù)蘇細(xì)胞，取培養(yǎng)72 h長滿單層且狀態(tài)良好的15 L轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞2瓶，按正常方式消化傳代，收集細(xì)胞懸液并計數(shù)，以（5～6）×105個/mL接入反應(yīng)器中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為2 000 mL，培養(yǎng)條件設(shè)置為pH 7.4、溶氧（DO）50%空氣飽和度、溫度37℃、轉(zhuǎn)速50 r/min。反應(yīng)器最大培養(yǎng)體積為7 L，購自廣州齊志工程設(shè)備有限公司。培養(yǎng)過程中采用通過空氣、O2、CO2方式調(diào)控pH與溶氧，當(dāng)pH與溶氧不能有效被控制時，采用添加7.5%NaHCO3進(jìn)行調(diào)控。每隔24 h取樣計數(shù)并觀察細(xì)胞狀態(tài)。生物反應(yīng)器按相同條件重復(fù)培養(yǎng)3次，每次收集細(xì)胞上罐密度，24 h、48 h、72 h的細(xì)胞密度、增長倍數(shù)和細(xì)胞狀態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 PK15細(xì)胞在方瓶中培養(yǎng)的生長情況 由表1可見，采用方瓶培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)分種密度在 （1～5）×104個/mL時，經(jīng)過72 h培養(yǎng)，細(xì)胞密度均能增值到（0.5～1.5）×106個/mL， 增長 10～30 倍，24 h、48 h、72 h的細(xì)胞狀態(tài)都良好。

2.2 PK15細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的生長情況 由表2可見，15 L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞， 當(dāng)分種密度在 （5～9）×104個/mL時，經(jīng)過72 h培養(yǎng)，細(xì)胞密度均能增值到（0.5 ～1.0）×106個/mL，增長 5～10 倍，且細(xì)胞狀態(tài)均良好。

2.3 PK15細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的生長情況由表3可見，生物反應(yīng)器培養(yǎng)PK15細(xì)胞，接種密度為（5～6）× 105個/mL，每隔 24 h 細(xì)胞能增長 2～3 倍，培養(yǎng)到72 h細(xì)胞能增長8～12倍，各時間段細(xì)胞狀態(tài)良好。

3 小結(jié)與討論

結(jié)果表明，PK15細(xì)胞在方瓶、轉(zhuǎn)瓶、生物反應(yīng)器中培養(yǎng)均能很好生長，培養(yǎng)72 h細(xì)胞最高密度分別能達(dá)到 1.5 ×106個/mL、1 ×106個/mL、8 ×106個/mL，且細(xì)胞在每個時間段都處于良好狀態(tài)。三種培養(yǎng)體系中，細(xì)胞增長倍數(shù)最大的是方瓶，增長10～30倍；其次是生物反應(yīng)器，增長8～12倍；最后是轉(zhuǎn)瓶，增長5～10倍。

表1 PK15細(xì)胞在方瓶中培養(yǎng)的生長情況

表2 PK15細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的生長情況

表3 PK15細(xì)胞在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的生長情況

細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境中，pH是培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵因素之一，它能影響細(xì)胞的粘附、存活與生長等功能。方瓶培養(yǎng)細(xì)胞可以通過5%CO2進(jìn)行pH平衡調(diào)控，對于轉(zhuǎn)瓶顯然該方法行不通，而生物反應(yīng)器是三種培養(yǎng)體系中最理想的培養(yǎng)系統(tǒng)。它不僅能穩(wěn)定pH，還可以穩(wěn)定溶氧、溫度、攪拌速度等，當(dāng)營養(yǎng)不足時可以及時補(bǔ)充營養(yǎng)如葡萄糖等使細(xì)胞處于最佳環(huán)境狀態(tài)。因此，穩(wěn)定的環(huán)境系統(tǒng)和營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用使反應(yīng)器培養(yǎng)的密度達(dá)到更高。試驗結(jié)果中反應(yīng)器培養(yǎng)密度最高能達(dá)到8×106個/mL也不足為奇。另外，方瓶培養(yǎng)是靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫和，與生物反應(yīng)器相比，細(xì)胞不受剪切力影響、液面的表面積大、溶氧基本可以滿足細(xì)胞要求[3]，試驗結(jié)果顯示方瓶培養(yǎng)細(xì)胞增長倍數(shù)最大，也許就是與這些因素密切相關(guān)。本試驗結(jié)果可以為生產(chǎn)制定PK15細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)化策略提供參考依據(jù)。