陳莉婷 左 俊 宋立榮 劉 津 甘南琴

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化問題日益加劇, 大范圍、高生物量、高危害特征的藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)。這不僅會(huì)破壞水體生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能, 制約湖泊水資源的可利用性, 危害人類及動(dòng)植物的健康生存, 也會(huì)影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。研究和發(fā)展控藻抑藻關(guān)鍵技術(shù), 對(duì)于湖泊水環(huán)境的健康發(fā)展和水資源的可持續(xù)利用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。與常規(guī)的物理法、化學(xué)法控藻技術(shù)相比,利用微生物控藻具有經(jīng)濟(jì)、特異、安全的優(yōu)勢(shì),是一種頗具應(yīng)用前景的修復(fù)、凈化富營(yíng)養(yǎng)化水體的方法, 引起了越來越多研究者的關(guān)注[1]?？v觀國(guó)內(nèi)外的研究, 微生物控藻法中報(bào)道最多的是利用溶藻細(xì)菌控制藍(lán)藻水華。這些溶藻細(xì)菌多為革蘭氏陰性菌, 一般分離自發(fā)生水華或赤潮的海洋、湖泊及水庫(kù), 少數(shù)分離自土壤, 適合在水華發(fā)生初期投入使用, 短期內(nèi)即可抑制藻類生長(zhǎng), 緩解甚至消除水華[2]。

溶藻細(xì)菌的脅迫能夠影響藻細(xì)胞內(nèi)的一系列生理過程, 比如阻礙電子傳遞降低藻細(xì)胞光合系統(tǒng)活性、抑制葉綠素a等色素合成或一系列與光合作用相關(guān)基因的表達(dá)、產(chǎn)生氧化損傷引起藻細(xì)胞膜脂過氧化和抗氧化酶失活、阻礙胞內(nèi)蛋白質(zhì)和碳水化合物合成、擾亂胞內(nèi)正常的離子代謝、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)引起細(xì)胞基質(zhì)外溢等[3—6]。

溶藻細(xì)菌篩選的常用方法為將已純化菌株的固體斜面純培養(yǎng)物或液體培養(yǎng)基中的純培養(yǎng)物接種到藻液中[7,8], 通過觀察藻液的黃化確定其是否為溶藻菌。菌株的純化和培養(yǎng)通常使用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)uria-Bertani(LB)培養(yǎng)基, 但大多數(shù)研究未關(guān)注LB培養(yǎng)基自身的抑藻作用及其在溶藻細(xì)菌篩選過程中的影響[9—11]。

本研究指出了使用細(xì)菌的LB液體純培養(yǎng)物篩選溶藻菌時(shí)存在風(fēng)險(xiǎn)和弊端, 并對(duì)篩選所得溶藻細(xì)菌的溶藻方式及溶藻活性物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生理活性的影響進(jìn)行了初步探究。一方面為溶藻細(xì)菌篩選方法的選擇提供參考, 另一方面為修復(fù)、凈化富營(yíng)養(yǎng)化水體的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用藻種為銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7806, 由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB)提供。藻株所用培養(yǎng)基為BG-11[12], pH為7.1—7.2。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃, 光照為25 μmol/(m2·s), 實(shí)驗(yàn)光源為冷光源(Philip), 光暗周期比為12h∶12h。藻細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 菌種分離與純化

從太湖竺山灣(31.45° N, 120.03° E)、梅梁灣(31.41° N, 120.19° E)采集藍(lán)藻水華水樣, 經(jīng)0.8 μm的濾膜(Millipore)過濾, 濾液用無菌水稀釋至不同梯度后涂平板, 再反復(fù)平板劃線分離純化菌株。細(xì)菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B: NaCl 10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、蒸餾水1000 mL, pH約為7.5。培養(yǎng)溫度為30℃, 轉(zhuǎn)速為140 r/min。配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加入1.5%(m/v)的瓊脂粉。

1.3 溶藻細(xì)菌的篩選及鑒定

LB液體純培養(yǎng)物感染藻細(xì)胞挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基, 培養(yǎng)48h后, 以10%的體積比將細(xì)菌培養(yǎng)物添加到藻液中, 另設(shè)一個(gè)加入等體積LB液體培養(yǎng)基的LB組, 空白對(duì)照組(CK組)藻液中加入等體積的無菌水。每2天取樣測(cè)定藻液的葉綠素a(Chlorophylla, Chl.a)濃度。

LB固體斜面純培養(yǎng)物感染藻細(xì)胞挑取單克隆接種于LB固體斜面, 待細(xì)菌菌落長(zhǎng)出, 用無菌水沖涮, 吹打均勻制成菌苔洗脫液, 最后用無菌水調(diào)配細(xì)胞密度至5×108cells/mL左右。以10%的體積比添加菌苔洗脫液到藻液中, 空白對(duì)照組(CK組)藻液中加入等體積的無菌水。每2天取樣測(cè)定藻液的葉綠素a濃度。

鑒定將溶藻菌的PCR產(chǎn)物送往公司測(cè)序,所測(cè)得的16S rDNA序列經(jīng)校對(duì)后, 在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用局部相似性基本查詢工具(BLAST)進(jìn)行核苷酸序列同源性比較。利用MEGA6.0軟件, 采用鄰接法(Neighbor-joining, 重復(fù)度F1000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對(duì)篩選出的溶藻細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定[11]。

1.4 LB培養(yǎng)基主要成分抑藻試驗(yàn)

配制與LB液體培養(yǎng)基中等濃度的酵母提取物溶液、蛋白胨溶液、NaCl溶液, 以10%的體積比分別添加至藻液中, 空白對(duì)照組(CK組)加入等體積的無菌水, 于12孔板中培養(yǎng)。每天搖勻3次, 一周后觀察各孔中藻液的生長(zhǎng)狀況。

將酵母提取物溶液以10%的體積比添加至藻液中, 空白對(duì)照組(CK組)加入等體積的無菌水, 于三角瓶中培養(yǎng), 測(cè)定實(shí)驗(yàn)過程中藻液的生物量變化。生物量以藻液在680 nm處的吸光值(OD680)來表示。

1.5 溶藻方式探究

分別將菌株THW7的無菌濾液、菌體重懸液、原始菌液以10%的體積比加入藻液中, 一周后取樣測(cè)定葉綠素a的濃度, 分析各處理液的溶藻效果。

1.6 溶藻活性物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生理活性影響的試驗(yàn)

將菌株THW7的無菌濾液以5%的體積比加入藻液中, 對(duì)照組加入等體積無菌水, 于500 mL三角瓶中培養(yǎng)。每組設(shè)置3個(gè)平行, 每2天取樣測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo), 生理指標(biāo)包括: OD680、葉綠素a濃度、Fv/Fm(最大光化學(xué)量子產(chǎn)量)、α(光能轉(zhuǎn)化效率)、ETRm(最大電子傳遞速率)、MDA(丙二醛)含量及抗氧化酶活性。(1)紫外可見分光光度法[13]測(cè)定藻液的葉綠素a濃度和OD680值; (2)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、α、ETRm用Water-PAM測(cè)定; (3)MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[14]; (4)SOD(超氧化物歧化酶)活性采用核黃素-NBT(氯化硝基四氮唑藍(lán))光化還原氧化法測(cè)定[15], POD(過氧化物酶)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[4], CAT(過氧化氫酶)活性采用鉬酸銨法測(cè)定[16], 粗酶液中可溶性蛋白含量利用南京建成生物工程研究所的蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.7 溶藻效果的評(píng)價(jià)

以葉綠素a的去除率表征溶藻效果, 公式如下:葉綠素a的去除率(%)=[(C0-C)/C0]×100)式中，C0為每組實(shí)驗(yàn)初始時(shí)的葉綠素a濃度(mg/L),C為每組實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)的葉綠素a濃度(mg/L)。

1.8 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理, 利用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。圖象繪制使用OriginPro 9.1。

2 結(jié)果

2.1 溶藻細(xì)菌的篩選及鑒定

本研究共分離、純化出93株細(xì)菌, 經(jīng)篩選鑒定共得到7株溶藻細(xì)菌, 這里僅以菌株THW4和THW7為例, 展示細(xì)菌篩選的不同結(jié)果。需指明的是研究中以LB固體斜面純培養(yǎng)物感染藻細(xì)胞的結(jié)果作為確定溶藻菌的標(biāo)準(zhǔn), 即LB固體斜面純培養(yǎng)物添加至藻液后能引起葉綠素a濃度顯著降低的菌株為溶藻細(xì)菌。

LB液體純培養(yǎng)物和LB固體斜面純培養(yǎng)物溶藻效果試驗(yàn)期間, 對(duì)照組微囊藻葉綠素a濃度持續(xù)升高; 各處理組的葉綠素a濃度降低(圖1A), 均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。菌株THW7的LB液體純培養(yǎng)物加入藻液后, 藻液葉綠素a濃度持續(xù)下降, 第2、第4、第6天葉綠素a濃度顯著低于其他各組(P＜0.01)。第6天時(shí)葉綠素a濃度為0.326 mg/L, 僅為初始水平的28.07%, 溶藻效率為71.93%。LB組和菌株THW4的LB培養(yǎng)物組葉綠素a濃度在第2天時(shí)均有不同程度的升高, 2d后開始呈下降趨勢(shì), 其中LB組的下降速率顯著高于菌株THW4培養(yǎng)物組的下降速率(P＜0.01)。第6天時(shí)LB組的葉綠素a濃度為0.685 mg/L, 溶藻效率為41.04%; THW4培養(yǎng)物組的葉綠素a濃度0.891 mg/L, 溶藻效率為23.34%。

菌株THW4的斜面洗脫液加入藻液后, 葉綠素a濃度逐漸升高, 趨勢(shì)與對(duì)照組相同; 菌株THW7的斜面洗脫液加入藻液后, 藻液明顯黃化, 葉綠素a濃度逐漸下降(圖1B), 顯著低于對(duì)照組和菌株THW4斜面洗脫液組(P＜0.01)。第6天時(shí), 菌株THW7斜面洗脫液組的葉綠素a濃度降至0.162 mg/L, 僅為初始水平的15.23%, 溶藻效率為84.77%。

圖1 兩株細(xì)菌不同培養(yǎng)物的溶藻效果Fig. 1 Algae-lysing effects of different culture solution of two bacteria in LB liquid culture

溶藻細(xì)菌的鑒定形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示溶藻細(xì)菌THW7為G-菌, 短桿狀, 接觸酶陽(yáng)性, 淀粉水解陰性, 能利用氨基酸和酯類, 菌落顏色為乳白色, 光滑、不透明、較濕潤(rùn)。利用16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 鑒定其為假單胞菌屬(Pseudomonas), 與蒂氏假單胞菌Pseudomonas teessideatype strain PR65T(AM419154.2)的親緣關(guān)系最近(圖2), 16S rDNA基因的相似性為99.79%。目前未見關(guān)于蒂氏假單胞菌溶藻的報(bào)道。

2.2 LB培養(yǎng)基不同成分抑藻效果

添加蛋白胨溶液和NaCl溶液的兩組藻液呈藍(lán)綠色, 藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好; 添加LB液體培養(yǎng)基和酵母提取物的藻液呈白色, 說明藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡(圖3)。

酵母提取物溶液添加至三角瓶中藻液的試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組藻生長(zhǎng)良好, OD680直線升高; 酵母提取物溶液組的藻從第2天開始迅速下降, 8d時(shí)OD680降至0.080(圖4), 顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.3 溶藻方式分析

試驗(yàn)初始的銅綠微囊藻葉綠素a濃度為1.162 mg/L。一周后, 對(duì)照組藻液生長(zhǎng)狀況良好; 原始菌液組、無菌濾液組的銅綠微囊藻生長(zhǎng)受到明顯抑制,藻液發(fā)黃甚至泛白, 葉綠素a濃度分別降至0.571和0.443 mg/L, 均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01), 溶藻效率分別為50.84%和61.84%; 菌體重懸液對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)幾乎沒有起到抑制作用, 葉綠素a水平與對(duì)照組基本一致, 無顯著性差異(圖5)。

2.4 銅綠微囊藻的生理指標(biāo)

生長(zhǎng)情況試驗(yàn)初始的銅綠微囊藻OD680為0.254, 葉綠素a濃度為0.817 mg/L。對(duì)照組藻液生長(zhǎng)狀況良好, OD680和葉綠素a濃度逐漸升高; 處理組OD680和葉綠素a濃度的變化趨勢(shì)相似, 逐漸下降(圖6), 顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。第10天時(shí), OD680降至0.041, 葉綠素a含量降至0.046 mg/L, 僅為初始水平的5.62%, 溶藻效率達(dá)94.38%。

光合系統(tǒng)活性試驗(yàn)期間對(duì)照組的銅綠微囊藻生長(zhǎng)狀況良好, 藻細(xì)胞的一系列葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、α、ETRm一直保持較高水平; 而投加溶藻菌THW7無菌濾液的處理組,Fv/Fm、α、ETRm呈迅速下降的趨勢(shì)(圖7), 均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。處理組的Fv/Fm在第6天降至0.032, 僅為初始值的9.94%, 第8天降為零。ETRm和α在試驗(yàn)初始約1h的樣品處理時(shí)間內(nèi)即開始降低, 第2天分別降低到試驗(yàn)初始值的21.81%、42.81%, 從第4天開始, 均降至檢測(cè)限以下。

圖2 溶藻細(xì)菌THW7系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree of the algalytic bacterium THW7

MDA含量及抗氧化酶活性對(duì)照組MDA含量始終維持在一個(gè)較低的水平; 處理組的MDA含量在第2天降至初始值的75.75%, 2d后迅速升高(圖8)。第4天時(shí)處理組的MDA含量升高至初始值的1.62倍, 顯著高于對(duì)照組的MDA含量(P＜0.05); 第6和第8天, 其MDA含量分別升高至初始值的1.99倍、2.77倍, 均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。

對(duì)照組酶活在一定范圍內(nèi)上下波動(dòng), 變化不大;處理組的SOD、POD、CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)且一直高于對(duì)照組, 其中CAT活性變化最顯著, 2d時(shí)即升至初始水平的9.47倍(圖9)。處理第4天、第6天, SOD活性分別升高至初始水平的1.25倍、1.73倍, POD活性分別升高至初始水平的1.90倍、6.19倍, CAT活性分別升高至初始水平的為初始水平的7.76倍和11.85倍, 均顯著高于對(duì)照組的相應(yīng)酶活性(P＜0.01)。處理第8天, SOD、POD活性雖大幅下降, 但仍高于對(duì)照組, 其中POD活性為初始水平的3.08倍。CAT活性在第8天未降低, 繼續(xù)升高至初始水平的14.15倍, 顯著高于對(duì)照組的CAT活性(P＜0.01)。

圖4 酵母提取物對(duì)藻生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of yeast extract on algae growth

圖5 溶藻細(xì)菌THW7不同處理液的溶藻效果Fig. 5 The algicidal effect of different THW7 treatment solutions

圖6 THW7的無菌濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響Fig. 6 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the growth of Microcystis aeruginosa, as determined by the OD680

3 討論

3.1 溶藻菌的篩選及溶藻方式的探究

LB培養(yǎng)基為常用的細(xì)菌培養(yǎng)基, 多用于溶藻細(xì)菌篩選過程中的菌株擴(kuò)培。多數(shù)研究采用細(xì)菌的LB液體培養(yǎng)物感染藻液來篩選溶藻菌, 但很少注意到LB培養(yǎng)基本身所具有的溶藻作用[9,10]。本研究結(jié)果表明, LB培養(yǎng)基具有一定的溶藻作用, 其主要成分酵母提取物具有較高的溶藻效率。鄭小平等[17]也發(fā)現(xiàn)添加培養(yǎng)基至藻液中導(dǎo)致葉綠素a濃度顯著下降, 第7天由初始值1.650 mg/L降至0.865 mg/L, 但并未對(duì)其進(jìn)行深入探究和解釋。另有研究雖然將LB培養(yǎng)基添加至藻液中作為對(duì)照, 但未曾發(fā)現(xiàn)其抑藻、溶藻作用[11], 這可能與其試驗(yàn)中LB培養(yǎng)基添加的比例較低有關(guān)。為避免培養(yǎng)基在篩選溶藻菌的過程中造成干擾, 部分研究在篩選溶藻菌時(shí)將液體培養(yǎng)物離心后反復(fù)洗滌[18], 但這一方法往往只能篩選得到直接溶藻的溶藻菌, 多數(shù)間接溶藻的細(xì)菌易被篩掉。因此采用LB液體純培養(yǎng)物感染藻液篩選溶藻菌存在較大的假陽(yáng)性或漏篩風(fēng)險(xiǎn)。

篩選溶藻菌的另一種方式為將固體斜面培養(yǎng)基上形成的菌苔收集后感染藻液, 通過藻細(xì)胞的生長(zhǎng)情況來確定菌株是否具有溶藻作用[9]。本研究中將兩株細(xì)菌THW4和THW7的LB固體斜面純培養(yǎng)物接種到藻液中, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有菌株THW7具有溶藻作用, 前者藻細(xì)胞正常生長(zhǎng), 與對(duì)照組無差異, 說明該方式可有效避免LB培養(yǎng)基帶來的干擾。因此在篩選溶藻菌時(shí), 應(yīng)使用菌株的LB固體斜面純培養(yǎng)物感染藻液或在利用LB液體純培養(yǎng)物篩選的過程中設(shè)置嚴(yán)格的空白對(duì)照, 或選用對(duì)藻生長(zhǎng)無影響的細(xì)菌培養(yǎng)基如改良基礎(chǔ)檸檬酸培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基等。

菌體重懸液中僅有菌體, 無菌濾液中僅有細(xì)菌的分泌物, 未經(jīng)任何處理的原始菌液既包含細(xì)菌的分泌物又包含菌體。本研究結(jié)果顯示同時(shí)含有細(xì)菌分泌物的無菌濾液組和原始菌液組均表現(xiàn)溶藻效果, 這表明THW7產(chǎn)生溶藻作用的因子為胞外分泌物, 菌體本身無溶藻效果, 即菌株THW7通過分泌溶藻活性物質(zhì)至胞外的方式間接溶藻。這是報(bào)道最多的一種溶藻方式, 氣單胞菌屬、假交替單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬等多通過的這種方式溶藻[19—23]。已有研究指出假單胞菌能分泌抗生素或生物堿類活性物質(zhì)溶藻[24,25],關(guān)于該菌的活性物質(zhì)組成有待進(jìn)一步研究。

圖7 THW7的無菌濾液對(duì)銅綠微囊藻光合活性的影響Fig. 7 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the photosynthetic activity of Microcystis aeruginosa

3.2 溶藻活性物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生理活性的影響

葉綠素a作為藻類細(xì)胞重要的組成成分, 也是可用來表征浮游植物生物量的最常用的指標(biāo)之一[13]。在本研究中, 添加溶藻細(xì)菌THW7無菌濾液后, OD680和葉綠素a濃度均顯著降低, 說明銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到顯著抑制。

光合作用的強(qiáng)弱可直接反映自養(yǎng)型生物的生長(zhǎng)情況, 而葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是一種方便、快速且靈敏的測(cè)量植物在逆境條件下光合作用的有效方法,它以植物體內(nèi)葉綠素作為探針[26]。通過測(cè)定活體的一系列葉綠素?zé)晒鈪?shù)如Fv/Fm、Yield、α、ETRm等, 就可知光能吸收、電子傳遞、光能轉(zhuǎn)化等過程的強(qiáng)弱, 這也能在一定程度上反映藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)活性, 表征微藻的生長(zhǎng)環(huán)境良好與否。在正常生理狀態(tài)下, 這些參數(shù)值比較穩(wěn)定、變化很小,但在脅迫條件下明顯下降[5]。在本研究中, 處理組的Fv/Fm、α、ETRm參數(shù)值均顯著下降直至檢測(cè)限以下, 這種變化比藻細(xì)胞生長(zhǎng)、MDA含量、抗氧化酶酶活的變化更迅速。這說明在THW7無菌濾液的脅迫下, 銅綠微囊藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)II迅速受到影響, 光合系統(tǒng)活性降低, 表現(xiàn)為電子傳遞受阻、光能轉(zhuǎn)化效率降低, 光合作用逐漸喪失。

圖8 THW7的無菌濾液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 8 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the MDA content in Microcystis aeruginosa

由不飽和磷脂構(gòu)成的細(xì)胞膜容易受到氧自由基攻擊和破壞, 導(dǎo)致MDA積累, 故其含量可作為表征生物細(xì)胞膜脂過氧化程度的重要指標(biāo), 反映細(xì)胞膜完整性被破壞的程度[3]。本研究中處理組的MDA含量從第4天開始一直增加, 顯著高于對(duì)照組。這表明在溶藻菌THW7無菌濾液的脅迫下, 藻細(xì)胞受到氧化損傷, 且細(xì)胞膜脂過氧化的程度隨著時(shí)間不斷加重。

藻類在正常代謝過程和各種環(huán)境脅迫下均能產(chǎn)生活性氧和自由基, 它的積累將引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和功能的紊亂, 生物機(jī)體出于自我保護(hù), 除了還原性谷胱甘肽(GSH)、類胡蘿卜素等非酶系統(tǒng)做出應(yīng)激防御, 體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)也起著重要作用, 通過生成各種抗氧化酶、升高酶活等使細(xì)胞內(nèi)的活性氧維持在較低水平以確保正常生長(zhǎng)和代謝[27],當(dāng)脅迫解除后, 酶活可得到不同程度的恢復(fù)。

藻細(xì)胞在受到脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), Su等[4]研究發(fā)現(xiàn)在一株銅綠假單胞菌脅迫下, 藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量逐漸積累, CAT、POD活性迅速升高后又急劇降低。Hou等[5]報(bào)道一株芽孢桿菌B1的液體培養(yǎng)物能夠降低藻細(xì)胞的葉綠素a含量, 抑制一系列與光合作用相關(guān)基因如psbA、psbD、rbcL等的表達(dá), 且MDA含量升高, 抗氧化系統(tǒng)和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損,最終藻細(xì)胞溶解死亡, 引起內(nèi)容物外泄。Kong[6]的研究也發(fā)現(xiàn)溶藻細(xì)菌脅迫引起抗氧化酶活性升高,且發(fā)酵液濃度越高, SOD、POD、CAT酶活升高程度越大。Shi等[28]甚至發(fā)現(xiàn)在棕鞭藻培養(yǎng)濾液的脅迫下, 微囊藻的生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制, MDA含量和CAT活性明顯增加。與以上研究相似, 本研究中一系列抗氧化酶活性在溶藻物質(zhì)的脅迫下總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 這說明在一段時(shí)間內(nèi)溶藻菌THW7所產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)會(huì)對(duì)微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗氧化系統(tǒng)造成一定的損傷。

圖9 THW7的無菌濾液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶酶活的影響Fig. 9 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the antioxidant enzyme activity in Microcystis aeruginosa

4 結(jié)論

LB培養(yǎng)基中的酵母浸提物具有一定的溶藻作用, 僅采用LB液體培養(yǎng)物進(jìn)行溶藻菌篩選存在假陽(yáng)性或高估溶藻效率的風(fēng)險(xiǎn), 而采用其固體斜面培養(yǎng)物篩選溶藻菌則可避免。篩選得到的溶藻細(xì)菌THW7通過分泌胞外活性物質(zhì)的方式間接溶藻, 該溶藻物質(zhì)會(huì)抑制銅綠微囊藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和光合作用, 破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性并使細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)受到損傷。