劉勝貴，馬海悅*，李智高，付彬彬，孔令羽

（云南綠新生物藥業(yè)有限公司，云南 曲靖 655000）

工業(yè)大麻為一年生草本植物，又名大麻、漢麻、火麻[1]，是指種子、莖、花梢（開花結果的梢）、花、葉及根部中的四氫大麻酚 (THC)含量小于0.3%的大麻屬植物。2003年1月，云南省公安廳制定了《云南省工業(yè)用大麻管理暫行規(guī)定》，規(guī)定四氫大麻酚 (THC)含量小于0.3%的大麻品種為允許種植的工業(yè)大麻。主要應用于食品、制藥、紡織、化妝品等行業(yè)，具有重大的潛在社會和經(jīng)濟價值[2-4]。

大麻素是大麻中特有的萜類次生代謝產(chǎn)物，目前報道的大麻素就有120多種，主要聚集在大麻植株的腺體毛中（主要在苞葉與嫩葉部位），最主要且含量較高的是大麻二酚（以下簡稱CBD） 和四氫大麻酚 (以下簡稱 THC）[4-5]。THC是大麻致幻物質的主要成分，也是導致許多國家禁種大麻的原因；CBD則能阻礙THC對人體神經(jīng)系統(tǒng)影響，有“反毒品化合物”的美稱[4-6]。CBD具有抗炎、抗驚厥、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凋亡和抗癌作用，在治療癲癇、多種癌癥、多發(fā)性動脈硬化與帕金森病、預防心肌梗死、抑制神經(jīng)膠質瘤細胞轉移和抑制性激素分泌等具有一定療效。目前CBD已被FDA批準用于治療難治性癲癇，是近年來的研究熱點[5、7-8]。

目前，CBD主要來源于工業(yè)大麻，主要從工業(yè)大麻花苞及嫩葉中提取，CBD含量是評價工業(yè)大麻質量的重要指標，故準確測定工業(yè)大麻花葉原料中的CBD含量十分重要。盡管種植的是工業(yè)大麻品種，仍需關注THC的含量，這對大麻毒品的監(jiān)測和控制有重要意義。目前，國內(nèi)外關于CBD與THC的檢測主要利用HPLC、GC-MS、LC-MS等，為此，本文研究參考相關文獻[3、8-12]，建立了一種HPLC檢測方法，用于測定工業(yè)大麻花葉中CBD和THC的含量，具有準確、穩(wěn)定等特點，可用于工業(yè)大麻的品質判定，對工業(yè)大麻質量控制具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

樣品：工業(yè)大麻花葉樣品，置于鼓風干燥箱干燥至恒重（水分小于5%），粉碎（細度≤0.425mm），混勻置于自封袋中保存，待測。（樣品來源：公司內(nèi)部樣品，本公司具備《云南省工業(yè)大麻種植許可證》）

儀器：Agilent 1260高液相色譜儀（包括G7111A四元泵，G7127A自動進樣器，G7116A柱溫箱，G7115A二極管陣列檢測器，OpenLab CDS2色譜工作站，美國Agilent公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5μm，美國 Agilent公司）；電子天平（FA1004B型，上海市安亭電子儀器廠）；超聲波清洗器（G-100S，深圳市歌能清洗設備有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE52-99，上海亞榮生化儀器廠）；純水儀（Master-S15/30UVF型，上海和泰儀器有限公司）；0.22μm有機相微孔針筒過濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）。

試劑：甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；水為自制超純水。四氫大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD） 標準品（1mg/mL，1mL，美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工作曲線制作

將CBD及 THC標準物質 （1mg/mL，1mL）分別轉移至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，得100μg/mL的CBD或THC標準溶液，移取一定量100μg/mL CBD或THC母液，逐級稀釋用甲醇定容，分別得CBD和THC濃度范圍約為1～100μg/mL系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品分析

稱取1g工業(yè)大麻花葉樣品于錐形瓶中，加入10mL甲醇，超聲提取30 min，然后過濾收集濾液，濾渣再用10mL甲醇超聲提取兩次，合并三次濾液，用旋轉蒸發(fā)儀（溫度40℃）濃縮除去部分溶劑，然后將濃縮液轉移至10mL容量瓶，用甲醇定容，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，進HPLC分析。若樣品處理液濃度超過標準工作曲線濃度范圍，則稀釋后再檢測。

HPLC條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱；流速：1mL/min，流動相A為水，流動相B為乙腈，等度洗脫， V（乙腈）：V（水） =65∶35；柱溫：30℃；進樣體積10 μL；檢測波長220nm。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

本試驗選擇了甲醇、乙醇、正己烷+乙酸乙酯（9+1）為提取溶劑，取同一個樣品，分別用不同溶劑提取，其余按本方法進行分析，采用樣品中CBD及THC的含量進行樣品提取評價，結果如表1。結果顯示，用正己烷+乙酸乙酯作為提取溶劑時，樣品中在THC標品出峰處未出峰，未檢出THC。但用甲醇和乙醇提取時均能夠檢出THC，故不使用正己烷+乙酸乙酯（9+1） 作為提取溶劑；甲醇和乙醇相比甲醇溶液提取效率最好。因此，本方法選擇甲醇作為提取溶液。

2.2 提取次數(shù)的選擇

充分提取目標物是定量分析中的重要因素，本實驗考察了提取次數(shù)對CBD和THC含量的影響。用甲醇提取四次，每次的提物液分別定容后進HPLC分析，其余按本方法進行處理，結果如表2。結果顯示，隨著提取次數(shù)的增加，CBD和THC的含量逐次減小，第四次的提取液中CBD和THC的含量均已非常低，可忽略，說明三次提取能夠充分將工業(yè)大麻花葉的CBD和THC成分提取，故本實驗選擇用甲醇提取三次。

表1 不同提取溶劑對CBD和THC提取效果的影響Tab.1 effects of different solvents on extraction of CBD and THC

表2 不同提取次數(shù)對CBD和THC提取效果的影響Tab.2 effects of different extraction times on extraction of CBD and THC

2.3 標準曲線、檢出限

按照1.2.1制作工作曲線，分別得CBD和THC濃度范圍為1～100μg/mL系列標準工作溶液，進行HPLC分析。以標準工作溶液目標物的色譜峰面積對其相應標準濃度進行回歸分析，得到標準曲線；以EPA方法計算方法的檢出限（LOD），結果見表3?？梢?，在1～100μg/mL范圍內(nèi)線性好，R2＞0.9997。CBD、THC標準品譜圖見圖1、圖2。

表3 方法線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限Table 3 linear regression equation,Correlation Coefficient,detection limit

2.4 精密度實驗

取工業(yè)大麻花葉樣品，用本實驗方法進行測定，做6個平行樣品，以評價本方法的精密度。結果見表4。結果表明，CBD和THC的相對標準偏差（RSD） 均小于3%。表明本方法可靠穩(wěn)定，重復性好。

2.5 回收率實驗

圖1 CBD標準品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC CHROMATOGRAM OF CBD Standard substance

圖2 THC標準品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC CHROMATOGRAM OF THC standard substance

表4 精密度實驗結果（n=6）Tab.4 precision test results（n=6）

分別加入高、中、低 （2μg/mL、5μg/mL、20μg/mL） 三個質量濃度水平的CBD和THC標準品溶液于空白樣品（不含CBD和THC的樣品）中，用本實驗方法進行測定，求得CBD和THC的回收率，結果見表 5。回收率為82.0%～102.8%，表明本方法回收率好，準確可靠。

表5 回收率實驗結果Tab.5 experimental results of recovery rate

2.6 樣品分析

按本試驗方法對3個工業(yè)大麻花葉樣品進行分析，結果見表6。樣品典型色譜圖（見圖3）。

3 結論

本方法采用HPLC同時測定工業(yè)大麻花葉中的 CBD和 THC，CBD的檢出限為 0.12μg/mL，THC的檢出限為0.08μg/mL，回收率在82.0%～102.8%，相對標準偏差（RSD）≤2.64%，可滿足工業(yè)大麻花葉中CBD和THC的準確測定。

表6 樣品分析結果Tab.6 results of sample analysis

圖3 工業(yè)大麻花葉典型樣品色譜圖Fig.3 chromatogram of typical samples of industrial hemp flowers and leaves