毛文浩，黃麗萍，馬 望，趙 環(huán)，張騰飛

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學醫(yī)學科學院，河南 鄭州 450052)

乳酸桿菌是一類可通過葡萄糖無氧代謝產(chǎn)生大量乳酸的細菌的總稱，在自然界中分布比較廣泛,也是人體腸道中較為常見的一類菌群。近年來,乳酸桿菌與腫瘤的相關研究備受關注[1],乳酸桿菌是維持機體平衡的最重要調(diào)控部分之一，可參與調(diào)控機體內(nèi)多種途徑。首先，乳酸桿菌可保持機體穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)微生物菌群與宿主之間的相互作用，維持結腸中理化條件的穩(wěn)定[2]；其次，乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性，可通過調(diào)控免疫系統(tǒng)來提高抗腫瘤作用，如激活機體的免疫效應細胞(淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞和自然殺傷細胞等)，促使腫瘤壞死因子、白介素(interleukin，IL)、干擾素(interferon，IFN)等多種細胞因子的分泌，提高機體的免疫水平，發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。迄今為止，已有大量研究[5]調(diào)查了腸道微生物群與致癌作用之間的相關性，但目前還未有關于羅伊氏乳酸桿菌對非小細胞肺癌患者(non-small cell lung cancer, NSCLC)免疫功能影響的相關報道，本研究從健康嬰兒糞便中篩選出來一株羅伊氏乳酸桿菌，初步分析了該益生菌培養(yǎng)基上清對NSCLC患者相關免疫細胞的影響，探討其潛在的抗腫瘤能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑MRS肉湯培養(yǎng)基購自美國Solarbio公司；熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本Takara公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自美國Biolgend公司；編碼16S核糖體亞基的基因鑒定(16S ribosomal deoxyribo nucleic acid identification，16S rDNA)測序及引物合成均由河南尚亞生物技術有限公司完成。

1.2 腸道菌群的分離用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)稀釋健康嬰兒糞便接種于MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下低氧培養(yǎng)24 h；在超凈臺中，用一次性接種環(huán)蘸取少量菌液在MRS固體培養(yǎng)板上劃線，放入培養(yǎng)箱，37 ℃低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)36 h，取出培養(yǎng)板后觀察可見有不同菌落長出，用無菌槍頭分別挑取單菌落至EP管中培養(yǎng)(450 μL MRS液體培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進行后續(xù)菌群鑒定。

1.3 菌群的16S rDNA鑒定應用16S rDNA通用引物制備50 μL反應體系(表1)進行PCR擴增，反應條件設定見表2。PCR反應結束后，取0.16 g瓊脂糖加入20 mL TAE溶液中，加熱至融化，配制質量分數(shù) 0.8% 的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120 V、20 min，放入凝膠呈像系統(tǒng)中觀察條帶；剩余PCR產(chǎn)物送河南尚亞生物技術有限公司進行測序，鑒定菌群。通用引物由河南尚亞生物技術有限公司合成，詳細序列見表3。

表1 16S rDNA鑒定PCR反應體系(50 μL)

表2 16S rDNA鑒定PCR反應條件

表3 16S rDNA鑒定通用引物序列

1.4 耐酸及耐膽鹽實驗

1.4.1 耐酸實驗 乳酸菌口服后需要通過胃液中的低酸性環(huán)境，可耐受低pH環(huán)境的菌株才能進入腸道發(fā)揮益生菌的功能。攝食后，食物在胃部停留約2 h,胃內(nèi)是一種相對酸性的環(huán)境，pH值在2.0～3.0之間，存在壁細胞的情況下會降至2.0[6]，該實驗測定在pH=2.0和pH=3.0的酸性培養(yǎng)條件下，測定該菌株在0～3 h后的存活情況。具體方法：細菌活化后4 ℃、2 500 r/min離心5 min收集菌體，使用無菌PBS洗滌2次后，分別加入到pH=2.0和pH=3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0、1、2和3 h后分別取菌液10 μL，無菌PBS稀釋菌液至100 μL后涂布在MRS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后計算存活率(即各時間段的活菌數(shù)與0 h的活菌數(shù)比值)。

1.4.2 耐膽鹽實驗 口服乳酸菌在胃部停留后進入小腸，通常在小腸中停留1～4 h,小腸中的膽鹽可對乳酸桿菌活性產(chǎn)生影響，腸道中膽鹽濃度約為0.3%，其高滲透壓容易損傷乳酸桿菌細胞膜的完整性[7]，本研究中選取質量分數(shù)0.3%、0.5%的膽鹽分別培養(yǎng)該菌株4 h，檢測羅伊氏乳酸桿菌對膽鹽的耐受情況。具體方法:在MRS液體培養(yǎng)基中分別加入質量分數(shù) 0.3%、0.5%的?；敲撗跄懰徕c(膽鹽)，過濾除菌；細菌活化后4 ℃、2 500 r/min離心5 min收集菌體，使用無菌PBS洗滌2次，分別接種于含有不同濃度膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，在培養(yǎng)過程中每隔1 h進行取樣檢測，10 μL樣品用無菌PBS稀釋至100 μL后涂布在MRS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后計算其存活率(即各時間段的活菌數(shù)與0 h的活菌數(shù)比值)。

1.4.3 黏附性實驗 將Caco-2細胞培養(yǎng)在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，在細胞培養(yǎng)箱中(37 ℃、體積分數(shù)5% CO2)培養(yǎng)48 h，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶表面70%～80%時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次，加入1 mL胰酶消化貼壁細胞，加入培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，按12的比例傳代，取穩(wěn)定傳至3代且細胞狀態(tài)較好的細胞接種于6孔板中(106個/孔)，更換不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，鋪滿培養(yǎng)瓶底部表面后更換為含有羅伊氏乳酸桿菌(1×109CFU/mL)的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2 h，使用無菌PBS洗脫未黏附到細胞上的菌體，加入胰酶消化并收集細胞，PBS稀釋10倍后涂布在MRS平板上，計算其黏附能力，該實驗設置3個平行對照。

1.4.4 抑菌能力的測定 將活化后的羅伊氏乳桿菌按1%的量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、低氧條件下培養(yǎng)12 h，在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，0.22 μm濾膜過濾后收集發(fā)酵上清液，根據(jù)瓊脂擴散法檢測羅伊氏乳酸桿菌的抑菌能力[5]。取100 μL蠟樣芽孢桿菌菌液、大腸桿菌、沙門氏菌(106CFU/mL)作為指示菌均勻涂抹于瓊脂培養(yǎng)基上，在無菌超凈臺上晾干，再用直徑為8 mm的牛津杯進行打孔。取200 μL上清液置于瓊脂板上孔中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，該實驗設置3個平行對照，根據(jù)抑菌圈平均值測定抑菌能力。

1.5 細菌的培養(yǎng)及樣品收集1)測定羅伊氏乳酸桿菌生長曲線：將羅伊氏乳酸桿菌活化后按1%的量接種于10 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、低氧條件下培養(yǎng)24 h，期間每隔2 h定時取樣，酶標儀檢測其在620 nm處的光密度值(OD620)，并以時間為橫坐標，OD620為縱坐標繪制羅伊氏乳酸桿菌的生長曲線；2)獲取穩(wěn)定期的羅伊氏乳桿菌：將羅伊氏乳酸桿菌按1%的接種量加入5 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃、低氧條件下培養(yǎng)12 h；取500 μL菌液加入50 mL MRS液體培養(yǎng)基中；37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至穩(wěn)定期，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，過濾除菌后收集上清液，凍干備用；3)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)刺激實驗：用1 mL無菌水溶解凍干后的上清備用；PBMCs計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL，取1 mL加入到12孔板中(約2×106個/孔)，實驗組加入10 μL溶解后上清與細胞共孵育24 h，對照組加入10 μL無菌水，24 h后取出培養(yǎng)板，1 000 r/min離心5 min分別收集細胞和上清，用于后續(xù)實驗。

1.6 PBMCs的提取1)吸取5 mL淋巴細胞分離液Ficoll加入到15 mL離心管中，做好相應標記；2)在乙二胺四乙酸抗凝管中抽取NSCLC患者5 mL靜脈血，在超凈臺中，血液與無菌PBS按照11的比例混勻，用吸管吸取混勻后的血液沿離心管內(nèi)壁緩慢加入到Ficoll液面上，小心保持血液在分離液上層；3)離心管在4 ℃、2 000 r/min條件下水平離心20 min；4)離心結束后離心管中液體分為3層，下層為紅細胞和中性粒細胞，上層為PBS稀釋后的血清，中間透明層是淋巴細胞分離液。在上層與中間層交界處呈現(xiàn)白色云霧狀，即單個核細胞；5)用無菌吸管緩慢移去上層大部分液體，然后緩慢插到白色云霧狀液體處，吸取單個核細胞，放入新的15 mL離心管中，并加入5倍數(shù)體積的無菌PBS, 1 000 r/min離心5 min，PBS反復洗滌細胞2次；6)離心結束后，棄上清,用含有體積分數(shù)15%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞,進行細胞計數(shù)；用臺盼蘭對細胞進行染色，區(qū)分死細胞與活細胞，計算細胞活力。

1.7 ELISA檢測上清中細胞因子含量在固相的抗體反應孔中加入稀釋液50 mL;將標準品及待測樣品加入反應孔中，封口孵育2 h；孵育結束后棄去各孔液體，每個孔中加入Plate Washing洗滌工作液200 μL，浸泡1～2 min，重復洗滌4次，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干；每個反應孔中加入100 μL酶標檢測抗體，室溫反應2 h；用Plate Washing洗滌工作液重復洗板4次；每微孔加入顯色劑100 μL，避光孵育30 min；微孔中加入Stop Solution終止反應液50 μL，此時可見孔內(nèi)液體由藍色變?yōu)辄S色；使用全波長酶標儀檢測450 nm光密度值，參比波長570 nm。

1.8 熒光定量PCR檢測收集PBMCs刺激實驗后的細胞，Trizol細胞裂解液提取細胞總RNA，使用Nanodrop one分光光度計測定提取RNA的純度，實驗中提取的RNA樣本純度應該在1.8～2.1之間，實驗取合格的RNA樣品進行后續(xù)逆轉錄反應，逆轉錄循環(huán)結束后得到互補DNA，應用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行熒光定量PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參基因，檢測目的基因的表達量=2-ΔΔCt，計算時取3個重復孔的平均Ct值(Ct值：反應體系中熒光信號達到既定域值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，△△Ct=實驗組△Ct-空白對照組△Ct，為確保結果準確，本實驗重復3次以上。

2 結果

2.1 羅伊氏乳酸桿菌的菌株分離與鑒定本研究從健康嬰兒糞便中分離出來單菌落，對其進行16S rDNA鑒定，16S rDNA通過PCR擴增后行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示：在155 bp處有明顯條帶，即成功應用PCR擴增出該菌落16S rDNA片段。根據(jù)PCR產(chǎn)物測序結果在美國國家生物信息中心網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，該菌株與羅伊氏乳酸桿菌的同源性為100%，證實該菌株為羅伊氏乳酸桿菌。電泳結果見圖1。

圖1 PCR擴增單菌落16S rDNA核酸電泳圖

2.2 測定羅伊氏乳酸桿菌的生長曲線在37 ℃、低氧條件下培養(yǎng)羅伊氏乳酸桿菌，細菌數(shù)目越多，OD620值越大。根據(jù)實驗結果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)4 h后，細菌增殖呈現(xiàn)指數(shù)式增長進入對數(shù)生長期，繼續(xù)培養(yǎng)至12 h細菌增殖逐漸進入穩(wěn)定期，在細菌增殖穩(wěn)定階段OD620值基本保持不變，此期細菌增殖數(shù)目與死亡數(shù)目漸趨平衡；18 h以后，OD620值逐漸開始下降，羅伊氏乳酸桿菌進入衰亡階段。根據(jù)細菌的生長曲線，在培養(yǎng)14 h時該菌株處于增殖穩(wěn)定期，便于細菌代謝的研究，因此該實驗在此時收集羅伊氏乳酸桿菌上清，用于后續(xù)研究益生菌的代謝產(chǎn)物對免疫系統(tǒng)的影響。羅伊氏乳酸桿菌的生長曲線見圖2。

圖2 測定羅伊氏乳酸桿菌的生長曲線

2.3 羅伊氏乳酸桿菌的益生菌特性耐酸實驗結果顯示：該菌在pH=2.0條件下，隨著時間增加，細菌死亡增加；在pH=3.0條件下，其存活率改變較少，菌株可產(chǎn)生適應性耐受，該菌可耐受胃液的酸性環(huán)境。見表4。

表4 羅伊氏乳酸桿菌在不同酸性環(huán)境中的存活率 %

膽鹽耐受實驗結果表明：該菌株在含有質量分數(shù)0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)顯示出較好的耐受性，隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞存活率逐漸降低，且始終高于在質量分數(shù)0.5%膽鹽中細胞的存活率。見表5。

表5 羅伊氏乳酸桿菌在不同濃度膽鹽條件下的存活率 %

黏附實驗結果顯示：羅伊氏乳酸桿菌在Caco-2細胞的黏附數(shù)為(793.0±54.0)CFU/100個細胞；羅伊氏乳酸桿菌對蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌、沙門菌具有明顯的抑制圈形成，即該菌株的代謝產(chǎn)物對上述有害菌群起到了抑菌作用。見表6。

表6 羅伊氏乳酸桿菌對指示菌的抑菌圈直徑 mm

注：抑菌圈直徑為20～30 mm時抑菌效果表示為+++；15～19 mm表示為++；10～14 mm表示為+；<10 mm表示為-

2.4 不同細胞中抗腫瘤細胞因子的相對表達量羅伊氏乳酸桿菌處理后的細胞中，IL-10、IL-12、IFN-γ的相對表達量均高于空白對照細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 不同細胞中抗腫瘤細胞因子的相對表達量比較

2.5 不同上清中抗腫瘤細胞因子的含量羅伊氏乳酸桿菌可以刺激PBMCs細胞分泌腫瘤免疫相關的細胞因子，羅伊氏乳酸桿菌處理后的細胞中IL-10、IL-12、IFN-γ的含量均高于空白對照細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表8。

表8 不同上清中抗腫瘤細胞因子的含量 ng/L

3 討論

傳統(tǒng)應用上，益生菌用于治療或預防由病原體引起或由抗生素治療引起的腸道菌群失衡，近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以刺激機體免疫系統(tǒng)，從而參與調(diào)節(jié)炎癥介質的合成與分泌，從而疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。Ferreira等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠的模型中，給予小鼠植物乳酸桿菌可以有效促進其免疫功能恢復。研究者應用雙歧桿菌的培養(yǎng)上清中的代謝產(chǎn)物刺激淋巴細胞可顯著提高其增殖能力，從而改善免疫功能，提高其在機體內(nèi)的抗腫瘤活性,益生菌代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)機體免疫功能以及維持腸道微生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[9]，并且可作為一種安全有效的免疫調(diào)節(jié)劑起到輔助抗腫瘤作用。

該研究從健康嬰兒糞便中篩選出來一株羅伊氏乳酸桿菌，該菌株具有較好的耐酸及耐膽鹽能力，黏附性較好，對腸道有害細菌有抑制作用，具有可抵抗胃腸液脅迫定植在腸道發(fā)揮益生菌功能的潛力；收集該菌株的培養(yǎng)上清液刺激NSCLC患者的PBMCs，檢測到IL-10、IL-12、IFN-γ等細胞因子的分泌。有研究[10-11]證實，IFN-γ具有多種生物活性，包括抗病毒作用和抗腫瘤作用，對實體瘤的生長和轉移有影響，IFN-γ可以直接抑制腫瘤的發(fā)生和調(diào)節(jié)機體細胞的免疫狀態(tài)殺傷腫瘤細胞；IL-10可通過可調(diào)節(jié)樹突狀細胞、減緩CD8+T細胞的凋亡，增強CD8+T細胞介導的抗腫瘤能力[12-13]；IL-12在針對惡性腫瘤的Th1型免疫應答中起著至關重要的作用，已被證明可調(diào)節(jié)先天免疫(自然殺傷細胞)和適應性免疫(細胞毒性T細胞)的功能，增強其殺傷腫瘤細胞的能力，在惡性腫瘤免疫治療研究中具有較大的研究前景[14]?？傊_伊氏乳酸桿菌的胞外多糖可通過刺激機體內(nèi)免疫效應相關細胞加速IL、IFN等細胞因子的分泌，提高機體免疫水平，發(fā)揮抗腫瘤作用的潛力。

乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性,在腫瘤的防治方面表現(xiàn)較大的應用潛力[15]，該研究為羅伊氏乳酸桿菌在提高機體免疫能力治療腫瘤方面提供理論基礎，隨著后續(xù)對其抗腫瘤機制的深入研究,在研發(fā)新型生物抗腫瘤制劑治療NSCLC中起到推動作用。乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物主要有胞外多糖、乳酸菌素、酸性代謝產(chǎn)物、γ-氨基丁酸等[16]，其中乳酸桿菌胞外多糖可作為安全有效的免疫調(diào)節(jié)物質起抗腫瘤作用，當前研究對乳酸桿菌胞外多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用取得一定的進展[3,9],但對其提高機體免疫能力和抗腫瘤的具體作用機制還需要進一步研究，為實現(xiàn)其臨床轉化提供依據(jù)。