姜博璠，張耀剛，沙長青，高瑞雪，楊海山，曹得萍

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病重點實驗室，西寧 810001；3.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，桂林 541101)

泡型包蟲病幾乎100%原發(fā)于肝臟，常伴有纖維組織增生和鈣化。有研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125b-5p在一些肝臟相關(guān)疾病中異常表達(dá)[1]，并在活化的肝星狀細(xì)胞中表現(xiàn)為增加顯著[2]。肝星狀細(xì)胞活化又是肝發(fā)生纖維化的主要原因[3]。目前國內(nèi)外關(guān)于泡型包蟲病患者血清miRNA差異表達(dá)的研究方向不同。本研究試圖驗證hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者組與健康對照組血清之間的相對表達(dá)量的差異。同時通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測其靶基因可能參與的信號傳導(dǎo)途徑，為今后泡型包蟲病分子標(biāo)志物的篩選提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本

實驗用血清樣本均來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病樣本庫。血清在病人未行任何治療時抽取(排除影響本研究結(jié)果的醫(yī)療行為)。

1.1.2 引物

實驗所使用的引物及內(nèi)參購于生工生物工程(上海)股份有限公司。引物及內(nèi)參的序列見表1。

表1 引物及內(nèi)參基因的序列

Table 1 Sequence of primers and internal reference gene

1.1.3 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑盒(RNAiso Plus，Takara，Cat#9108)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MiR-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit，Takara，Code.638313)，熒光定量試劑盒(TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ，Takara，RR820A)；反轉(zhuǎn)錄PCR儀(GeneAmp?PCR System 9700，ABI)，實時熒光定量儀器(LightCycler?480Ⅱ，Roche)和超微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop 2000c，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

每份血清取0.5 mL按照Takara試劑盒說明書步驟提取總RNA。取1 μL總RNA在超微量核酸蛋白測定儀上檢測其濃度及純度，取兩次測量的平均值。當(dāng)A260 nm/A280 nm的比值符合反轉(zhuǎn)錄要求時方可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗。反轉(zhuǎn)錄依照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，按要求配制10 μL反應(yīng)液[mRQ Buffer(2×)5μL，RNA sample(0.25～8μg)3.75μL，mRQ Enzyme1.25μL]，配置好反應(yīng)液后按如下反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min。反轉(zhuǎn)所得cDNA加90 μL無酶水稀釋后置-20 ℃冰箱。

1.2.2 q-PCR及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.2.3 hsa-miR-125b-5p基因的生物信息學(xué)分析

靶基因篩選所用數(shù)據(jù)庫為starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php)、miRDB(http：//mirdb.org/)、miRwalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRTarBase(http：//miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)數(shù)據(jù)庫。將starBase、miRDB、miRwalk三個數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的靶基因交集，與miRTarBase數(shù)據(jù)庫提供的已經(jīng)取得實驗驗證的靶基因取合集。GO分析和KEGG的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析所用數(shù)據(jù)庫為Enrichr(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)、KEGG(https：//www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫。以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選通路。用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因所編碼的蛋白之間的相互作用，可信度最高的相互作用分?jǐn)?shù)為0.900?？尚哦纫蕾嚳疾彀ㄎ谋就诰颉嶒烌炞C等7個方面。

2 結(jié)果

2.1 qPCR結(jié)果及統(tǒng)計分析

患者組和對照組擴增曲線明顯，溶解曲線無雙峰。數(shù)據(jù)見表2。

表2 qPCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Table 2 qPCR data

hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者組血清中的表達(dá)量高于健康對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義。柱狀圖見圖1。

Control組為健康對照組，Treated組為泡型包蟲病患者組

圖1 hsa-miR-125b-5p在健康對照組和泡型包蟲病患者組中的相對表達(dá)量圖

Figure 1 Relative expression of hsa-miR-125b-5p in healthy controls and alveolar echinococcosis in patients

2.2 靶基因預(yù)測

hsa-miR-125b-5p在starBase、miRDB、miRwalk數(shù)據(jù)庫中預(yù)測靶基因數(shù)分別為219、925、10 879個。取交集后獲得靶基因163個。miRTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測到由實驗數(shù)據(jù)支持的靶基因134個。為保證本實驗靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性，我們將兩組靶基因合并，得到靶基因267個(兩個集合含有30個相同靶基因)。見圖2。

圖2 hsa-miR-125b-5p靶基因預(yù)測流程圖

Figure 2 Flow chart of hsa-miR-125b-5p target gene prediction

2.3 靶基因的GO分析和KEGG通路分析

將所預(yù)測的267個靶基因經(jīng)Enrichr、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析和通路分析。富集分析顯示三個部分，分別為生物過程部分、分子功能部分和細(xì)胞組分部分。具體富集功能見圖3。其中對細(xì)胞凋亡(在生物過程中的，P<0.05)、MAP激酶激酶活性(在分子功能中的，P<0.05)的調(diào)節(jié)可能調(diào)控了肝臟的細(xì)胞凋亡和纖維化，與泡型包蟲病患者肝臟病變相符合。通路分析總共分析出228個通路，其中參與調(diào)控的靶基因數(shù)大于15的通路見表3。在這些通路中，hsa-miR-125b-5p的部分靶基因發(fā)揮重要作用。與肝臟纖維病變關(guān)聯(lián)密切的通路有肝細(xì)胞癌通路、MAPK信號通路等，見圖4、5。

圓圈的大小代表靶基因數(shù)目，顏色深淺代表對P值再統(tǒng)計后的q值

圖3 GO分析散點圖

Figure 3 GO analysis scatter plot

表3 KEGG分析的主要通路及其參與基因

Table 3 Main pathways of KEGG analysis and their participating genes

黃色標(biāo)記基因為hsa-miR-125b-5p的靶基因

The yellow marker genes are the target genes of hsa-miR-125b-5p

圖4 肝細(xì)胞癌通路中的TGF-β通路圖和MAPK通路圖

Figure 4 TGF-β pathway map and MAPK pathway map in hepatocellular carcinoma pathway

黃色標(biāo)記基因為hsa-miR-125b-5p的靶基因

2.4 靶基因所編碼蛋白間的作用

將hsa-miR-125b-5p所預(yù)測的靶基因合集分別輸入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建顯示共有275個節(jié)點和284個邊緣，并確定了6個關(guān)鍵基因(degree>20)：TP53、AKT1、EGFR、MAPK14、SMAD4、STAT3，見圖6。這些關(guān)鍵基因在蛋白相互作用網(wǎng)中處于主要節(jié)點位置，相互之間緊密關(guān)聯(lián)，其在肝細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤突變中發(fā)揮重要作用。

圓圈大小和顏色代表靶基因的可信度，連接線的粗細(xì)和顏色代表連接分?jǐn)?shù)

圖6 hsa-miR-125b-5p靶基因編碼蛋白TP53網(wǎng)絡(luò)相互作用圖

Figure 6 Interaction map of hsa-miR-125b-5p target gene encoding protein TP53 network

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)肝臟中的miRNA水平與許多血清中的miRNA水平相關(guān)[4]。來自肝臟的miRNA可以通過細(xì)胞凋亡和壞死方式被動地進(jìn)入血清，或通過外泌體和病毒顆粒的分泌積極地進(jìn)入血清[5]。它們可以作為肝損傷和癌癥的生物標(biāo)志物[6]。

本課題組前期通過基因芯片檢測了泡型包蟲病患者組與健康對照組血清中miRNA的表達(dá)情況。其中表達(dá)差異明顯的基因主要有hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-377-5p、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-4725-3p、hsa-miR-3165等。此外有相似研究指出，泡型包蟲病患者肝臟病變組織與邊緣帶組織存在差異的miRNA有hsa-miR-1237-3p、hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4306等[7]。目前研究表明，血清中hsa-miR-125b-5p的升高與肝臟損害的嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)，其可能是慢性乙肝合并肝功能衰竭預(yù)后不良的預(yù)測指標(biāo)[8]，而泡型包蟲病患者肝臟病變以纖維組織增生和鈣化為主，對肝臟的損害程度極大。因此本課題組首先選取了基因芯片結(jié)果中表達(dá)差異明顯的hsa-miR-125b-5p做進(jìn)一步驗證及研究。

q-PCR驗證得出hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者血清中呈高表達(dá)。GO分析和KEGG通路分析顯示，hsa-miR-125b-5p主要調(diào)節(jié)的靶基因集中在癌癥通路及MAPK信號通路中。hsa-miR-125b-5p調(diào)節(jié)的癌癥通路中的重要靶基因Smad4是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad途徑的重要成員之一，該途徑參與了肝臟的纖維化[9]。Smad2、Smad3被激活后與Smad4結(jié)合形成異源三聚體進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖[10，11]。此外，MAPK通路也是參與肝臟纖維化的重要通路之一。有研究表明[12]，肝纖維化時主要參與的細(xì)胞是活化的肝星狀細(xì)胞，而阻斷MAPK通路中的p38可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，p38可以對肝星狀細(xì)胞的增殖發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用p38通路抑制劑(SB202190和ML3403)阻斷蟲體P38信號通路，可以有效抑制體外多房棘球絳蟲的存活率，并且對人正常細(xì)胞無影響[13]。在hsa-miR-125b-5p的靶基因所調(diào)節(jié)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，主要參與基因有MAPK14、SMAD4、TP53、AKT1、EGFR、STAT3。這些基因在肝臟的病變及細(xì)胞的增殖和代謝中發(fā)揮著重要作用。比如AKT1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中異常表達(dá)，并且與細(xì)胞行為高度相關(guān)，包括增殖、存活、新陳代謝和腫瘤發(fā)生[14]。研究表明在肝細(xì)胞癌中EGFR常常表現(xiàn)為過表達(dá)，并發(fā)揮關(guān)鍵作用，突出了EGFR在肝臟疾病發(fā)展中的重要性[15]。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明hsa-miR-125b-5p的靶基因及其調(diào)控蛋白涉及多種生物學(xué)功能，符合泡型包蟲病患者肝臟病變尤其是肝臟纖維化的特點。在樣本收集時排除患者其他并發(fā)癥的基礎(chǔ)上，本研究所預(yù)測的信號通路和重要靶基因與泡型包蟲病的發(fā)病可能有關(guān)聯(lián)。下一步研究將會在體外肝細(xì)胞培養(yǎng)中將hsa-miR-125b-5p過表達(dá)，觀察其對肝細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞活力等方面的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者組血清中的含量相對于健康對照組是增加的。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示hsa-miR-125b-5p的靶基因調(diào)控的肝細(xì)胞癌通路及MAPK通路在肝臟纖維化的病變中發(fā)揮著重要作用。MAPK14、SMAD4、TP53、AKT1、EGFR、STAT3這6個關(guān)鍵靶基因參與了肝細(xì)胞纖維化、增殖及腫瘤病變發(fā)展的過程，其中SMAD4、MAPK14所涉及的TGF-β1/Smad信號通路和MAPK信號通路更是直接促進(jìn)了肝包蟲病患者肝纖維化的改變。hsa-miR-125b-5p或許可以作為泡型包蟲病生物標(biāo)志物之一，但具體機制仍需進(jìn)一步研究與驗證。