周義玲，張 昱，紀(jì)巧榮，寇 娜，穆罕默德·杰馬，袁周陽，劉 杰，韓 瑩，申香群，張 偉，3△

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，中國(guó) 西寧 810001；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院，中國(guó) 臺(tái)州 318000；3.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 西寧 810001)

高原低氧是否會(huì)對(duì)腸道黏膜免疫系統(tǒng)在抵御外源性微生物過程中產(chǎn)生影響尚不明確。本研究以十二指腸感染了鼠多形螺旋線蟲Heligmosomoidespolygyrus(H.polygyrus，Hp)和腸道鼠枸櫞酸桿菌Citrobacterrodentium(C.rodentium，Cr)的小鼠為模型，探討低氧對(duì)蠕蟲和細(xì)菌混合感染小鼠腸道黏膜免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠30只，體重(18±2)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物的使用和處理經(jīng)過青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模

小鼠飼養(yǎng)于溫度為(20±2)℃、相對(duì)濕度為(40±5)%的IVC鼠籠中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組：常氧對(duì)照組(Control組。青海西寧，海拔2 260m：大氣壓582mmHg，PO2121.6mmHg)、低氧對(duì)照組(H-Control組。低壓艙：海拔5 000m，大氣壓405mmHg，PO284.7mmHg)、常氧H.polygyrus感染組(Hp組)、低氧H.polygyrus感染組(H-Hp組)、常氧H.polygyrus和C.rodentium混合感染組(Hp+Cr組)、低氧H.polygyrus和C.rodentium混合感染組(H-Hp+Cr組)，每組5只。首先將Hp+Cr組和H-Hp+Cr組感染H.polygyrus(L3期幼蟲200條/只)，1周后再感染C.rodentium(2.5×109CFU/只)，感染(C.rodentium)兩周后開腹(無菌)取材。為了保證造模條件的一致性，其余四組的處理時(shí)間均為第3周最后一天。在造模期間稱量小鼠體重以觀察其在低氧和感染條件下的體重變化。

1.2.2H.polygyrus和C.rodentium活化

鏡下觀察顯示4 ℃下儲(chǔ)存的L3期H.polygyrus幼蟲活動(dòng)度良好，計(jì)數(shù)H.polygyrus幼蟲并經(jīng)口感染小鼠(L3期幼蟲200條/只)，感染3周后取材并收集小鼠糞便培養(yǎng)，培養(yǎng)1周后收集新的L3期H.polygyrus幼蟲于試管中并保存于4 ℃冷藏柜備用。Hp+Cr組和H-Hp+Cr組感染H.polygyrus一周后再感染C.rodentium。首先在C.rodentium(strain DBS100；ATCC number 51459)凍干粉中加入無菌水，復(fù)溶后取菌液在麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)(37℃，過夜)，其余菌液分裝凍存于-80 ℃冰箱，次日取一個(gè)菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液變渾濁后檢測(cè)其吸光度值并計(jì)算相應(yīng)的濃度及體積。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

將小鼠用CO2麻醉后于心臟取血，靜置2 h后離心(3381g)10 min，收集血清備用；用75%酒精消毒后開腹，取出小腸測(cè)量其長(zhǎng)度；取十二指腸上段沿縱切面剖開，鏡下分檢H.polygyrus并計(jì)數(shù)；截取0.5 cm十二指腸行OCT包埋做常規(guī)冰凍切片。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清中IgE、IgG1抗體濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

抗小鼠1stAb、標(biāo)準(zhǔn)品和抗小鼠2ndAb(IgE、IgG1)均購自美國(guó)BD公司；辣根過氧化物酶、TMB顯色液及濃硫酸購自上海玉博生物科技有限公司；OCT購自美國(guó)Sakura Finetek公司；HE染料購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠外在表現(xiàn)

Control組和Hp組整體表現(xiàn)良好，無明顯異常。Hp+Cr組小鼠在感染細(xì)菌5～7天后，狀態(tài)萎靡、便稀軟、脊柱隆起、毛發(fā)枯燥，有輕微的便血；H-Hp+Cr組各項(xiàng)癥狀出現(xiàn)較早，且明顯為重。

2.2 小鼠體重

小鼠體重變化見圖1。重復(fù)測(cè)量分析小鼠體重變化：各組小鼠體重變化符合線性關(guān)系，F(xiàn)=154.971，P<0.01，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，Hp+Cr組和H-Hp+Cr組小鼠體重均低于相應(yīng)的單純感染組(P<0.05)，Hp組與Control組比，小鼠體重?zé)o明顯變化，而合并C.rodentium感染時(shí)，體重明顯降低(P<0.05)，提示單純H.polygyrus感染對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響；各低氧組小鼠體重均低于常氧組(P<0.05)，其中以H-Hp+Cr組小鼠體重降低最為明顯，顯示低氧處理會(huì)使小鼠體重降低。

圖1 小鼠體重變化量圖

Figure 1 Changes Mice Body weight

2.3 小鼠小腸長(zhǎng)度

小鼠小腸長(zhǎng)度見表1。結(jié)果顯示：與Control組相比，Hp組和Hp+Cr組的小腸明顯增長(zhǎng)(P<0.05)。Hp組與Hp+Cr組比較無顯著性差異。與H-Control組相比，H-Hp組和H-Hp+Cr組小腸均增長(zhǎng)(P<0.05)。各低氧組小腸長(zhǎng)度均長(zhǎng)于相應(yīng)的常氧組(P<0.05)，提示低氧條件會(huì)使小腸長(zhǎng)度增長(zhǎng)。

表1 小鼠小腸長(zhǎng)度

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Hp組比較，P<0.05；◆：與Hp+Cr組比較，P<0.05；●：與H-Control組比較，P<0.05

2.4 小鼠十二指腸H.polygyrus數(shù)目

十二指腸H.polygyrus數(shù)目見表2。與Hp組比較，Hp+Cr組H.polygyrus數(shù)目明顯增多，有顯著性差異(P<0.05)；H-Hp+Cr組H.polygyrus數(shù)目較H-Hp組多(P<0.05)；各低氧感染組H.polygyrus數(shù)目明顯多于相應(yīng)的常氧組(P<0.05)。其中，H-Hp+Cr組H.polygyrus數(shù)目最多。

表2 小鼠十二指腸H.polygyrus的數(shù)目

GroupnThenumberofH.polygyrusHp580.6±8.1H-Hp5114.0±11.7#Hp+C595.2±9.8#H-Hp+Cr5142.5±13.3◆■F- 27.284P- 0.000

#：與Hp組比較，P<0.05；◆：與Hp+Cr組比較，P<0.05；■：與H-Hp組比較，P<0.05

2.5 小鼠血清抗體濃度

血清抗體濃度見表3。與Control組相比，Hp組和Hp+Cr組血清IgE、IgG1濃度均明顯升高(P<0.05)，其中Hp+Cr組IgE濃度高于Hp組(P<0.05)，而IgG1則相反。與H-Control組相比，H-Hp組和H-Hp+Cr組血清IgE濃度均明顯升高(P<0.05)，且H-Hp+Cr組IgE濃度高于H-Hp組，有顯著性差異(P<0.05)；與H-Control組相比，H-Hp組IgG1濃度明顯升高(P<0.05)，H-Hp+Cr組IgG1濃度無明顯變化，且H-Hp+Cr組IgG1濃度低于H-Hp組。H-Hp組和H-Hp+Cr組IgE濃度明顯低于相應(yīng)的常氧組；低氧H-Hp+Cr組IgG1濃度低于Hp+Cr組。

表3 小鼠血清免疫球蛋白含量

Table 3 The concentration of serum immunoglobulin in mice

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Hp組比較，P<0.05；△：與Cr組比較，P<0.05；◆：與Hp+Cr組比較，P<0.05；●：與H-Control組比較，P<0.05；■：與H-Hp組比較，P<0.05；★：與H-Cr組比較，P<0.05

2.6 小鼠十二指腸形態(tài)

十二指腸形態(tài)學(xué)變化見圖2。Control組十二指腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜基本完好，肌層厚薄均勻；H-Control組表現(xiàn)為輕微黏膜破損，與Control組比無明顯差異；Hp組、H-Hp組、Hp+Cr組和H-Hp+Cr組均有不同程度的形態(tài)學(xué)改變，H-Hp+Cr組尤為明顯，十二指腸組織結(jié)構(gòu)完整性破壞明顯，黏膜破損嚴(yán)重，上皮大量脫落，并伴有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)至固有層和肌層。

A：Control組，十二指腸組織結(jié)構(gòu)基本完整，肌層厚薄均勻；B：H-control組，有輕微的黏膜破損；C：Hp組，黏膜破損較Control組明顯，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；D：H-Hp組，破損較Hp組明顯；E：Hp+Cr組，有明顯的上皮脫落和炎細(xì)胞浸潤(rùn)；F：H-Hp+Cr組，破壞最嚴(yán)重，有大量的上皮脫落及炎細(xì)胞浸潤(rùn)至固有層和肌層

圖2 小鼠十二指腸形態(tài)變化圖(HE staining，×200)

Figure 2 Morphological changes of duodenum in mice(HE staining，×200)

3 討論

腸道黏膜是機(jī)體免疫系統(tǒng)最大也是最為復(fù)雜的部分[1]，作為阻止腸道病原菌入侵的第一道防線，對(duì)于維持機(jī)體健康起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)機(jī)體受到寄生蟲、細(xì)菌等外界病原體入侵時(shí)[例如像導(dǎo)致嚴(yán)重嬰幼兒腹瀉的腸致病性大腸桿菌(Entero-pathogrnicEscherichiacoli，EPEC)感染[2]]，腸道黏膜免疫系統(tǒng)就會(huì)發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制來保護(hù)機(jī)體免受傷害。H.polygyrus是一種自然源性的嚙齒類動(dòng)物腸道線蟲[3]，主要寄生于小鼠十二指腸。當(dāng)感染H.polygyrus時(shí)，宿主就會(huì)產(chǎn)生以Th2型免疫反應(yīng)為主的免疫功能來預(yù)防和清除寄生蟲。青藏高原常見的細(xì)粒棘球絳蟲，其幼蟲寄生于人或家畜，為人獸共患病，稱為包蟲病。主要流行于我國(guó)西北牧區(qū)，其幼蟲進(jìn)入機(jī)體后也可刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1、Th2免疫反應(yīng)，其誘導(dǎo)的Th2型免疫反應(yīng)為主導(dǎo)反應(yīng)[4]。因此，研究H.polygyrus感染的免疫學(xué)機(jī)制，可為早期預(yù)防和診斷高原包蟲病提供理論基礎(chǔ)。C.rodentium是一種定植在結(jié)腸末端的革蘭陰性桿菌，是小鼠特異性的細(xì)菌病原體，有研究表明其編碼黏附功能的基因與EPEC具有功能同源性[5]，因此很適合研究EPEC的發(fā)病機(jī)制。

本研究記錄了整個(gè)小鼠疾病過程中體重的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，各低氧組體重均低于常氧組，提示在高海拔低氧狀態(tài)下，機(jī)體由于應(yīng)激反應(yīng)，使腸道缺血缺氧加重[6]，從而抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致食欲減退。另外，低氧混合感染組體重明顯低于低氧蠕蟲感染組和低氧對(duì)照組，說明在低氧條件下，蠕蟲合并細(xì)菌感染時(shí)，加重了對(duì)消化功能的影響，最終引起體重減輕。

研究結(jié)果顯示，常氧和低氧條件下蠕蟲感染組和混合感染組小鼠小腸長(zhǎng)度均增長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期的研究結(jié)果也表明蠕蟲感染時(shí)小腸長(zhǎng)度增長(zhǎng)可能與肥大細(xì)胞活化脫顆粒及分泌型上皮細(xì)胞增多有關(guān)；各低氧組小腸長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于相應(yīng)的常氧組，是由于缺氧會(huì)引起胃腸道反應(yīng)性減弱、胃腸平滑肌舒張。鏡下分檢H.polygyrus并計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，各混合感染組H.polygyrus數(shù)目明顯多于單純?nèi)湎x感染組，提示合并C.rodentium感染時(shí)，C.rodentium會(huì)影響機(jī)體對(duì)H.polygyrus的排除；各低氧感染組H.polygyrus數(shù)目明顯多于常氧感染組，可能是由于低氧條件引起腸黏膜缺血、缺氧加重、小腸蠕動(dòng)減弱等導(dǎo)致機(jī)體對(duì)H.polygyrus的清除能力減弱。

IgE是一種由黏膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞分泌的免疫球蛋白，在腸道黏膜免疫系統(tǒng)的形成及抵抗病原體入侵中起著越來越重要的作用[7]，近年來，有研究[8，9]表明，IgE在腸道寄生蟲感染者血清中的含量顯著升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在常氧和低氧條件下單純?nèi)湎x感染組和混合感染組血清中IgE的濃度明顯升高，而混合感染組IgE的濃度明顯高于蠕蟲感染組，可能與C.rodentium感染影響H.polygyrus數(shù)目增多有關(guān)。另外，Th2型細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)可通過多種途徑活化B細(xì)胞，誘導(dǎo)IgE合成，使血清中IgE的水平升高[10]，本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)尚未發(fā)表的研究結(jié)果顯示，混合感染組腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞分泌IL-4水平升高，這可能也是混合感染組IgE濃度明顯升高的原因。

IgG是血清和細(xì)胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是全身性體液免疫的主要效應(yīng)分子，在機(jī)體抗感染免疫中起著重要作用。有研究[11]表明，寄生蟲感染時(shí)伴有高水平的IgG1，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在常氧和低氧條件下各感染組的IgG1水平明顯升高，但混合感染組IgG1水平則低于單純?nèi)湎x感染組，提示C.rodentium也會(huì)影響H.polygyrus誘導(dǎo)的Th2型免疫反應(yīng)。各低氧感染組IgE的濃度均明顯低于各常氧感染組，IgG1的濃度與相應(yīng)的常氧感染組相比也有下降趨勢(shì)，提示低氧會(huì)影響IgE、IgG1的產(chǎn)生。SaiRam M等研究[12]表明，低氧下免疫球蛋白濃度明顯降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過模擬低氧條件下腸道蠕蟲和細(xì)菌混合感染模型，研究低氧對(duì)混合感染小鼠腸道黏膜免疫功能的影響。結(jié)果顯示，低氧暴露會(huì)損傷腸黏膜且使血清IgE、IgG1抗體濃度降低，影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮其免疫功能，加重H.polygyrus和C.rodentium導(dǎo)致的腸道損傷。機(jī)體的免疫應(yīng)答包括先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，后者又包括主要由T細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及B細(xì)胞所介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)中我們主要對(duì)低氧條件下體液免疫應(yīng)答的改變進(jìn)行了簡(jiǎn)單分析，還應(yīng)進(jìn)行高海拔低氧暴露對(duì)機(jī)體固有免疫應(yīng)答和特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的相關(guān)研究，包括T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)正在做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究；對(duì)于參與腸道黏膜免疫系統(tǒng)的各項(xiàng)信號(hào)通路的檢測(cè)也極其重要，本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)正在做相關(guān)計(jì)劃，以完善有關(guān)高原低氧對(duì)腸道黏膜免疫系統(tǒng)影響的研究。