普冰清，張曉南，李東嫻，曹紅云，徐 怡，游 燕

(云南省藥物研究所，云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111)

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 儀 器

Agilent1100高效液相色譜儀；AB204-N電子分析天平，Mettler Toledo；SK250HP數(shù)控超聲波清洗器，上?？茖?；DHG-9037A電熱恒溫干燥箱，上海精宏。

1.1.2 藥品與試劑

甲醇、乙腈均為色譜純試劑，默克公司；鹽酸、異硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈、醋酸鈉、冰醋酸均為分析純試劑。

十八種氨基酸對照品(140624-200805，除了甲硫氨酸的純度為99.7%，其余氨基酸的純度為100%)購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 樣 品

實驗用山楂果收集于云南玉溪，不同成熟程度的山楂鮮果各3批，采集至實驗室后及時清理、曬干至水分不高于12.0%。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

二是由缺乏技巧、不順暢義等外顯出來的狀態(tài)、水平，發(fā)展成為對事物所處狀態(tài)的判斷和評價。如《尚書》：“作偽，心勞日拙?！笨装矅鴤鳎骸盀閭危椙砂俣?，于心勞苦，而事日拙不可為?！盵1](P488)由此，“拙”具有“困窮、艱難”義。

分別精密稱取十八種氨基酸適量，加0.1 mol·L-1的鹽酸溶液制得含門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、鹽酸賴氨酸及色氨酸0.1 mg·L-1的對照品儲備液。精密吸取10 mL儲備液置于50 mL容量瓶中，分別加入0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯乙腈溶液5 mL，1.0 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液5 mL，搖勻。室溫下放置1 h后加入50%乙腈溶液并定容至刻度，搖勻。精密吸取20 mL上述溶液移入分液漏斗中，加入正己烷20 mL，振搖，放置10 min后取下層溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 供試品溶液的制備

供試品溶液的制備：取本品細粉約0.5 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入6 mol·L-1的鹽酸溶液10 mL密封，混勻，于105 ℃烘箱中加熱1 h后移出，冷卻至室溫，再加入12 mol·L-1的NaOH溶液5 mL進行中和，過濾。精密吸取10 mL儲備液置于50 mL容量瓶中，參照2.1項中“分別加入0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯乙腈溶液……取續(xù)濾液，即得?！蓖瓿珊罄m(xù)樣品處理。

1.2.3 色譜條件

Agilent1100高效液相色譜；色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(5 μm，4.6×150 mm)；按表1采用梯度洗脫法，流動相以0.05 mol·L-1醋酸鈉溶液(用冰醋酸調節(jié)pH值至6.5)為A相，乙腈:甲醇:水(60:20:20)為流動相B；流速1.0 mL·min-1；檢測波長254 nm；進樣量10 μL；柱溫35 ℃。

根據(jù)上述色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，進樣，測定，即得。

表1 洗脫梯度Table 1 The gradient elution

2 結果與討論

2.1 含量測定方法學驗證

2.1.1 標準曲線

分別取系列濃度的對照品工作溶液10 mL，按照“2.1”項方法衍生，按照“2.3”項色譜條件進樣分析，以峰面積A為縱坐標，質量濃度C(mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，見表2。

表2 18種氨基酸標準曲線表Table 2 The table of standard curve of 18 amino acids

續(xù)表2

2.1.2 精密度考察

取混合標準品溶液，按照“1.2.1”項方法衍生，按照“2.3”項色譜條件連續(xù)進樣6次，RSD%均小于2.0%，說明儀器的精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定。RSD%均小于2.0%，說明24 h內樣品的穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復性考察

精密稱取同一批號的供試品6份，按“1.2.2”項制備供試品溶液，分別進樣，記錄峰面積，計算游離氨基酸含量，RSD%均小于2.5%，說明方法重復性好。

2.1.5 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的山楂0.25 g，加入對照品適量，制備6份，分別測定。對照品的加樣回收率均在96.21%到104.56%之間，RSD%均小于2.8%，說明加樣回收率良好。

2.2 樣品含量測定

圖1 不同成熟程度山楂果中氨基酸含量Fig.1 The contents of amino acids in Crataegus pinnatifida at different maturity

從圖1及表3中可知，山楂青果中氨基酸含量較低，只有22 mg·g-1左右，半熟果中氨基酸含量最高為85 mg·g-1以上，全熟果中氨基酸含量有所降低為67 mg·g-1左右。同時三種果中均檢出了7種氨基酸，分別為丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及賴氨酸。其中含量最高的為谷氨酸，半熟果中谷氨酸含量高達70 mg·g-1以上，而青果中含有14 mg·g-1左右。半熟果與全熟果中氨基酸含量差別較大的為谷氨酸，相差20 mg·g-1左右。

表3 不同成熟程度山楂果中氨基酸含量(n=3)Table 3 The contents of amino acid in Crataegus pinnatifida at different maturity (n=3)

注：氨基酸含量以干燥品計。

3 結 論

山楂是中國特有的藥果，具有降血脂、血壓、強心等作用，同時也是健脾開胃、消食化滯、活血化痰的良藥[3-4]。氨基酸是山楂中的營養(yǎng)基礎及風味物質，其含量也一定程度上影響著山楂的品質。本實驗采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法對不同成熟程度的山楂果進行處理，采用HPLC對其中18種氨基酸進行含量測定，分析山楂成熟過程中氨基酸的動態(tài)變化特征。檢出了7種氨基酸，分別為丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及賴氨酸，其中谷氨酸含量最高，同時在山楂果的成熟過程中，總氨基酸及谷氨酸含量呈先大量增加后有所回落的趨勢，在山楂果半熟時總氨基酸及谷氨酸含量最高，全熟時含量稍低于半熟。本實驗以山楂成熟過程中游離氨基酸成分的動態(tài)變化為研究對象，以期為山楂的品質研究提供參考。