李宜檀，鐘斯卉，翟新卉，金祥飛，沈衛(wèi)陽

(中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 210009)

細(xì)辛腦，又名α-細(xì)辛腦或α-細(xì)辛醚，化學(xué)名為(E)-2,4,5-三甲氧基-1-丙烯基苯，英文名為Asarone。自20世紀(jì)60年代開始，國內(nèi)外對(duì)菖蒲屬植物的有效成分細(xì)辛腦進(jìn)行研究，包括提取、合成、藥理、毒理及臨床應(yīng)用研究[1-2]，發(fā)現(xiàn)細(xì)辛腦具有抗炎、止咳、祛痰、平喘等藥理作用，在臨床中主要用于治療肺炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病。細(xì)辛腦難溶于水，先后被開發(fā)成片劑、膠囊劑、霧化吸入劑、前體脂質(zhì)體、注射劑等劑型[3]。目前，細(xì)辛腦注射液通過靜脈注射使用，具有起效快的特點(diǎn)，細(xì)辛腦注射液有關(guān)物質(zhì)檢查方法的研究報(bào)道相對(duì)較少[4-7]，且細(xì)辛腦注射液標(biāo)準(zhǔn)未收載于國外藥典，因此開發(fā)準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易操作的有關(guān)物質(zhì)檢查方法可有助于全面、有效控制細(xì)辛腦注射液的質(zhì)量，保證臨床用藥安全。

1 材料與儀器

1.1 試 劑

細(xì)辛腦原料藥(批號(hào)：170501)，廣西億康；細(xì)辛腦注射液(自制，規(guī)格2 mL：8 mg)；細(xì)辛腦對(duì)照品(批號(hào)100298-201203)，中國食品藥品檢定研究院；β-細(xì)辛腦對(duì)照品(純度96%，批號(hào)：1-NYL-34-1)，TRC；甲醇(AR，批號(hào)0211191103)，國藥集團(tuán)；娃哈哈純凈水。

1.2 儀 器

LC-2010CHT高效液相色譜儀，日本島津制作所；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；BT25S電子分析天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XW-80A渦旋混合儀，上海青浦滬西儀器廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RX-C18(4.6×250 mm，5 μm)；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：258 nm；流動(dòng)相為甲醇-水(70:30)。

2.2 系統(tǒng)適用性

取細(xì)辛腦20 mg，加甲醇適量溶解后，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中含0.2 mg的溶液。取適量，置紫外燈(365 nm)下照射30 min后，作為系統(tǒng)適用性溶液。取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，雜質(zhì)β-細(xì)辛腦峰(相對(duì)保留時(shí)間為0.9)與細(xì)辛腦峰間的分離度為2.9。

2.3 專屬性

取細(xì)辛腦注射液0.5 mL，置10 mL量瓶中，分別進(jìn)行以下試驗(yàn)：①酸降解試驗(yàn)：加入0.5 mol/L的鹽酸溶液破壞1 h；②堿降解試驗(yàn)：加入0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液破壞1 h；③氧化降解試驗(yàn)：加入30%過氧化氫溶液破壞1 h；④高溫降解試驗(yàn)：加入流動(dòng)相，置100 ℃水浴3 h；⑤光照降解試驗(yàn)：加入流動(dòng)相，置4500 lux強(qiáng)光照射箱中照射1 h。隨行開展未降解試驗(yàn)作為平行對(duì)照。降解完畢，溶液放至室溫，加流動(dòng)相稀釋至刻度。取上述降解樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果表明，α-細(xì)辛腦在酸性、氧化及光照條件下不穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)的量顯著增加，但各雜質(zhì)峰均與α-細(xì)辛腦完全分離，峰純度滿足要求；α-細(xì)辛腦在高溫及堿性條件下較穩(wěn)定。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of specificity test

2.4 線性與校正因子

α-細(xì)辛腦線性。取α-細(xì)辛腦對(duì)照品25 mg，精密稱定，加甲醇適量溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋制成α-細(xì)辛腦為0.1000、0.2001、0.5002、1.000、2.001、3.001、4.002 μg/mL的溶液。

表1 α-細(xì)辛腦和β-細(xì)辛腦的線性范圍與校正因子Table 1 Linear ranges and relative response factor of α-asarone and β-asarone

β-細(xì)辛腦線性。取β-細(xì)辛腦對(duì)照品25 mg，精密稱定，加甲醇適量溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋制成β-細(xì)辛腦為0.1003、0.2007、0.5017、1.003、2.007、3.010、4.014 μg/mL的溶液。取上述線性樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線法[8]計(jì)算雜質(zhì)β-細(xì)辛腦相對(duì)于α-細(xì)辛腦的校正因子，結(jié)果見表1。

2.5 精密度、重復(fù)性

進(jìn)樣精密度。取“2.4”線性項(xiàng)下2.007 μg/mL的溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，RSD(n=6)為0.62%，保留時(shí)間RSD(n=6)為0.21%。

重復(fù)性。照“3”有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下配制分別供試品溶液和對(duì)照溶液各6份，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定6份供試品溶液中有關(guān)物質(zhì)的含量，按照加校正因子的主成分高低濃度自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量，試驗(yàn)結(jié)果見表2，該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性結(jié)果Table 2 The results of repeatability

2.6 檢測(cè)限、定量限

取“2.4”線性項(xiàng)下最低濃度溶液經(jīng)稀釋法測(cè)定，β-細(xì)辛腦的定量限為0.4 ng，最低檢出限為0.1 ng。

2.7 回收率

采用雜質(zhì)對(duì)照品加樣回收試驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確度。取β-細(xì)辛腦對(duì)照品20 mg，精密稱定，稀釋配制成濃度為19.97 μg/mL的雜質(zhì)儲(chǔ)備液。取雜質(zhì)儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋制至刻度，搖勻，作為β-細(xì)辛腦對(duì)照品溶液。取細(xì)辛腦注射液0.5 mL，置10 mL量瓶中，共10份，其中一份用流動(dòng)相稀釋制至刻度，搖勻，作為回收率供試品溶液；其余9份分別加雜質(zhì)儲(chǔ)備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL各三份，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得回收率加樣供試品溶液。取回收率供試品溶液、回收率加樣供試品溶液、β-細(xì)辛腦對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3，雜質(zhì)β-細(xì)辛腦的回收率(n=9)為：100.9%；RSD為：1.1%，可見該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 回收率結(jié)果Table 3 The results of accuracy

2.8 穩(wěn)定性

取“2.5”重復(fù)性項(xiàng)下的供試品溶液和對(duì)照溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得β-細(xì)辛腦及雜質(zhì)總量，RSD分別為1.5%、1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性

使用另一臺(tái)液相色譜儀(LC-2010CHT)，另一根色譜柱CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，依建立的色譜方法，進(jìn)行細(xì)辛腦注射液的有關(guān)物質(zhì)檢查，細(xì)辛腦與有關(guān)物質(zhì)的分離度為2.9，檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)均為2個(gè)，雜質(zhì)β-細(xì)辛腦及其它雜質(zhì)的量基本一致。

3 有關(guān)物質(zhì)檢查

表4 細(xì)辛腦注射液有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Table 4 Results of related substances of asarone injection

取細(xì)辛腦注射液0.5 mL，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，用流動(dòng)相稀釋100倍，作為對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液1.0 mL，用流動(dòng)相稀釋20倍，作為靈敏度溶液。取靈敏度溶液20 μL，注入液相色譜儀，S/N大于10，取供試品溶液、對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍，按照加校正因子的主成分高低濃度自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量。經(jīng)檢驗(yàn)，3批自制細(xì)辛腦注射液中有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果見表4。

4 討 論

4.1 流動(dòng)相選擇

反相色譜法的有機(jī)相主要為甲醇與乙腈，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了這兩種溶劑對(duì)峰形、分離度、理論板數(shù)、拖尾因子的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇-水(70:30)、乙腈-水(60:40)時(shí)均能獲得較好的分離度且峰形對(duì)稱性良好，但乙腈-水體系出峰較甲醇-水體系晚。從經(jīng)濟(jì)、溶劑毒性方面考慮，選擇甲醇-水(70:30)體系為流動(dòng)相。

4.2 波長選擇

細(xì)辛腦在波長258 nm和313 nm處有最大吸收，其主要雜質(zhì)β-細(xì)辛腦在252 nm和302 nm處有最大吸收。根據(jù)方法驗(yàn)證結(jié)果，選擇258 nm為檢測(cè)波長，能有效檢測(cè)雜質(zhì)的含量，且檢測(cè)靈敏度更高。

專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，本品不具有光穩(wěn)定性，在光照條件下，細(xì)辛腦易轉(zhuǎn)化成β-細(xì)辛腦，雜質(zhì)量增加，因此試驗(yàn)過程應(yīng)進(jìn)行避光操作。

5 結(jié) 論

本方法用于檢查細(xì)辛腦注射液的有關(guān)物質(zhì)，其操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確靈敏，重現(xiàn)性好，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證符合細(xì)辛腦注射液有關(guān)物質(zhì)檢查要求，可用于細(xì)辛腦注射液質(zhì)量控制。