徐健鑫,扆幸運,李曉明,丁龍君,朱永官,4,*

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心土壤環(huán)境研究室, 北京 100085 2 中國科學(xué)院大學(xué)中丹學(xué)院, 北京 100049 3 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 4 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所, 廈門 361021

甲烷(CH4)是繼二氧化碳(CO2)之后第二大溫室氣體,其較強的紅外線吸收能力使其單分子增溫的潛力是CO2的20—30倍[1- 2]。目前全球每年CH4排放量約5×108—6×108t,其中約70%來源于微生物作用[3]。產(chǎn)甲烷菌是其中最大的貢獻者。產(chǎn)甲烷菌是地球上最古老的生命形式之一[4],廣泛分布于稻田、海洋沉積物、厭氧消化器等厭氧環(huán)境中[5- 7],是復(fù)雜有機質(zhì)厭氧降解的重要推動者[8]。根據(jù)碳源差異,產(chǎn)甲烷菌的能量代謝方式可分為：以H2或甲酸為電子供體還原CO2、乙酸發(fā)酵及甲基營養(yǎng)型等三種[9]。

稻田是我國最重要的人工濕地生態(tài)系統(tǒng),也是CH4排放的人為源之一[10]。每年來源于稻田的CH4排放量約2×107—1.2×108t,中國位于世界首位[11]。氧化鐵是稻田土中最豐富的氧化物。多形態(tài)、高化學(xué)活性的氧化鐵在周期性干濕交替的稻田土壤中表現(xiàn)出活躍的價態(tài)變化,影響著其他營養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)[12-13]。有研究報道,由微生物介導(dǎo)的鐵還原直接影響著甲烷合成等其他代謝途徑[14]。Jackel等研究發(fā)現(xiàn)向水稻土中添加15或30 g/kg水鐵礦時,甲烷釋放的抑制效率分別可達43%和84%[15]；Peng等向不同植區(qū)水稻土中添加葡萄糖后發(fā)現(xiàn)土壤中Fe(II)的產(chǎn)生量與CH4的釋放量顯著相關(guān),并提出以Fe(II)/[Fe(II)+Fe(III)]預(yù)估CH4排放量的模型[16]。然而,目前關(guān)于鐵氧化物對產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的影響報道較少。

本研究通過泥漿厭氧培養(yǎng),以甲酸鹽為產(chǎn)甲烷底物,水鐵礦為唯一電子受體,探究添加鐵氧化物(鐵還原)對產(chǎn)甲烷菌的群落組成的影響。本實驗將為探究水稻土中鐵還原與碳代謝間耦合的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水鐵礦的制備

水鐵礦(Fe5HO8·H2O[12])的制備方法參照Schwertmann和Cornell[17]進行了適當修改。用去離子水配制0.4 mol/L FeCl3溶液,并用1.0 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.0。然后用10倍體積的去離子水洗滌、離心沉淀(5000 r/min,10 min),直到上清液中Cl-濃度小于1 mmol/L。將洗好的沉淀冷凍干燥,研磨過篩(0.07 mm),室溫保存。

1.2 無菌缺氧去離子水的制備

向去離子水中添加微量刃天青作為氧化還原指示劑,將無菌針頭插入液面以下并通入高純N2,加熱并維持沸騰狀態(tài)30 min,以去除去離子水中的溶解氧,此時液體成粉紫色；稍冷,加入0.3 g/L L-半胱氨酸,持續(xù)微熱并通入高純N2至液體變?yōu)闊o色；迅速封裝,高壓滅菌(121℃,20 min),冷卻待用。

1.3 泥漿厭氧培養(yǎng)

土壤樣品采自湖南省桃源縣長期施肥實驗站(28°21′N,116°92′E)。采集土壤表層0—20 cm,并去除樣品中細小的沙石和根系,放入無菌自封袋中密封,冷藏運回實驗室。將樣品風干過篩(1 mm),充分混勻。

由于微生物對甲酸鹽的大量消耗,在10 d培養(yǎng)期間每天向體系中按7 μmol/g的濃度補充甲酸鹽,且培養(yǎng)結(jié)束時(記為第10天)體系中幾乎沒有甲酸鹽剩余。

1.4 泥漿DNA提取及16S rRNA基因測序

取培養(yǎng)第0、10天的泥漿0.5 g(干土計),用FastDNA Spin Kit for Soil(MP bio,CA,USA)試劑盒提取泥漿 DNA。選擇16S rRNA基因的V4高變區(qū)(ArBa515f_Arch806r)進行擴增,20 μL PCR體系包括：4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,前、后引物各0.8 μL,0.4 μL FastPfu Polymerase,0.2 μL BSA和2 μL DNA,剩余用無菌水補齊。PCR反應(yīng)條件如表1。樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

表1 PCR反應(yīng)引物和反應(yīng)條件

1.5 數(shù)據(jù)分析

初始數(shù)據(jù)分析采用Excel 2016進行,采用SPSS(20.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進行顯著性分析(one-way ANOVA)。計算香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)描述古菌群落的α多樣性,基于Weighted normalized Unifrac距離算法進行主坐標分析。將相對豐度發(fā)生顯著差異的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列比對,利用MEGA的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,檢驗方法為bootstrap,重復(fù)1000次。

圖1 培養(yǎng)結(jié)束前、后微生物群落組成 Fig.1 Barplot of microbial community structure in CK and Fh treatments at day 0 and 10 CK：對照處理 Control；Fh：水鐵礦處理 Ferrihydrite.誤差線為三組重復(fù)的標準偏差,上方的小寫字母為不同處理培養(yǎng)前后的顯著性差異(P<0.05)

2 結(jié)果

2.1 古菌群落多樣性變化分析

基于16S rRNA基因測序結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)微生物群落大多由細菌構(gòu)成,古菌占比不足30%,且培養(yǎng)結(jié)束后僅CK處理中古菌所占比例顯著(P<0.05)升高,Fh處理中無顯著變化(圖1)。

進一步從OTU水平上分析CK和Fh兩組處理中古菌群落組成的多樣性,發(fā)現(xiàn)兩組處理中香農(nóng)指數(shù)均極顯著下降(P<0.001),而辛普森指數(shù)極顯著上升(P<0.001,圖2)。這說明添加甲酸鹽處理10天后,不僅降低了體系中古菌群落的物種多樣性,同時降低了OTU水平上古菌群落的均一性。另外,發(fā)現(xiàn)與CK相比,添加水鐵礦盡管可以降低微生物群落結(jié)構(gòu)中古菌的占比,但對古菌群落組成的多樣性沒明顯影響?；赪eighted normalized Unifrac算法的主坐標分析(圖3)表明經(jīng)10天厭氧培養(yǎng),CK和Fh處理的古菌群落結(jié)構(gòu)均與培養(yǎng)前明顯不同,且兩者培養(yǎng)后的古菌群落組成也具有顯著差異；主坐標解釋了總方差的82.84%。

圖2 培養(yǎng)前、后泥漿中古菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)(*** P<0.001)Fig.2 Barplot of Shannon index and Simpson index of archaea in CK and Fh treatments at day 0 and 10

圖3 培養(yǎng)前、后泥漿中古菌OTU水平的主坐標分析圖Fig.3 Principal co-ordinate analysis plot for archaea community structure in CK and Fh treatments at OTU level

2.2 OTUs水平上古菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

為進一步分析添加甲酸鹽和水鐵礦對古菌群落的影響,我們對比不同處理中培養(yǎng)前后每個OTU在體系中的相對豐度,最終發(fā)現(xiàn)OTU 2056,OTU 911,OTU 3870,OTU 2032,OTU 1970,OTU 2456,OTU 1931和OTU 895等8個培養(yǎng)后相對豐度發(fā)生顯著(P<0.05)變化的OTU(圖4)。其中,僅OTU 2056和OTU 911相對豐度升高,分別占CK和Fh處理古菌群落的80%和76%；根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析,兩者均與Methanobacterium具有較近的親緣關(guān)系。OTU 2032和OTU 2456僅在CK處理中相對豐度下降,它們與Methanosarcina具有較高的相似性；而OTU 1931和OTU 895相對豐度變化僅發(fā)生于Fh處理中,與Methanocellales較為相似。

圖4 厭氧培養(yǎng)10天后CK處理和Fh處理中相對豐度顯著變化的OTUs及其系統(tǒng)發(fā)育分析(*P<0.05,*** P<0.01,*** P<0.001)Fig.4 Phylogenetic tree of OTUs whose relative abundance change significantly after 10-day anaerobic incubations in control and Fh treatment

圖5 厭氧培養(yǎng)10天后Fh和CK處理中OTU差異的韋恩圖 Fig.5 Venn diagram of OTU difference between CK and Fh after 10-day incubations

3 討論

甲酸是生物大分子降解過程中除乙酸外又一重要的中間代謝產(chǎn)物[18],也是大多H2營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌可以利用的一種底物[10]。從能量角度上,除直接還原CO2/CO途徑以外,以甲酸鹽為電子供體是微生物最容易產(chǎn)甲烷的途徑[10]。本研究結(jié)果顯示,以甲酸鹽為底物進行泥漿厭氧培養(yǎng)后,體系的古菌群落結(jié)構(gòu)從OTU水平上發(fā)生了明顯的改變(圖3),其物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)的均一性均顯著降低(P<0.05,圖2)。造成這一結(jié)果的原因是添加甲酸鹽刺激了OTU 2056和OTU 911的顯著富集(P<0.001,圖4),使其成為古菌中的主要優(yōu)勢種,從而降低了其他如Methanosarcina、Methanocellales和Crenarchaeote等類似古菌的相對豐度。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示這兩個OTU均與Methanobacteriumbryantii有較高的相似性。M.bryantii在系統(tǒng)發(fā)育上與M.formicicum相似,兩者都能利用甲酸鹽產(chǎn)H2和CH4[19]。Bryant等最早發(fā)現(xiàn)M.bryantii可以利用S菌株氧化乙醇的產(chǎn)物H2合成甲烷,降低了H2累積對S菌株生長的抑制,從而實現(xiàn)了兩者的互營共生[20]。之后,Guyot等也發(fā)現(xiàn)M.bryantii可以利用甲酸,與DesulfovibriovulgarisJJ共生產(chǎn)甲烷[21]。我們的體系中是否也存在著這種互營關(guān)系有待進一步確認。

水稻土中存在著豐富的鐵氧化物,在周期性灌溉-排水的管理模式下,鐵也發(fā)生了活躍的價態(tài)變化,并影響著其他生命活動[13,22]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加水鐵礦培養(yǎng)后,古菌在全部微生物群落中的占比沒有發(fā)生明顯變化,顯著低于CK處理(P<0.05)。這與早期的研究報道一致。微生物(細菌)介導(dǎo)的鐵還原與產(chǎn)甲烷過程競爭電子和底物,因此與不發(fā)生鐵還原相比,產(chǎn)甲烷菌的生長會受到抑制[5]。但我們進一步發(fā)現(xiàn),CK和Fh處理培養(yǎng)前后古菌群落的α多樣性沒有差異,且培養(yǎng)后兩個處理組中的優(yōu)勢種均為OTU 2056和OTU 911,占比也相似。這說明添加水鐵礦對古菌群落的遷移沒有主導(dǎo)作用。培養(yǎng)后83% OTUs同時存在于CK和Fh處理中(圖5),也驗證了這一結(jié)論。

4 結(jié)論

添加甲酸鹽可以有效地富集土壤中Methanobacteriumbryantii的類似微生物；添加鐵氧化物只能從總體上減少古菌占微生物總體的比重,但對古菌群落的多樣性和均一度以及顯著富集的菌株類型沒有影響。因此,在有機物的厭氧降解過程中,鐵氧化物可能只通過抑制產(chǎn)甲烷菌的生長減少甲烷的釋放,而對主要發(fā)揮功能的菌株不具選擇作用。