張曉曦,張玲玲,雷航宇,王思妤,董 玉,米皓皓,劉增文

1 延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心, 延安 716100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所, 楊凌 712100 3西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 楊凌 712100

石油是全球最為重要的礦產(chǎn)資源之一,可為人類提供能源、材料、化工產(chǎn)品等,在推動(dòng)工業(yè)和農(nóng)業(yè)發(fā)展以及經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方面起到了不可替代的作用。然而,隨石油需求量的不斷增加,供需矛盾迫使更多陸地儲(chǔ)量被動(dòng)用,而在上述開發(fā)過程中因不當(dāng)操作或事故產(chǎn)生的原油泄漏則對(duì)石油產(chǎn)區(qū)產(chǎn)生了日趨嚴(yán)重的環(huán)境危害[1- 3]。石油污染物進(jìn)入土壤后往往將堵塞土壤孔隙、惡化土壤水分特征,誘發(fā)土壤養(yǎng)分失衡,并因其選擇性脅迫導(dǎo)致微生物多樣性和多種酶活性降低[4- 7]。上述影響將顯著破壞土壤的生態(tài)功能,導(dǎo)致其為生物提供生長(zhǎng)環(huán)境和生產(chǎn)介質(zhì)、調(diào)節(jié)養(yǎng)分循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力降低,最終引發(fā)污染區(qū)生態(tài)退化和其他環(huán)境問題。

自然狀況下,土壤中石油污染物可在微生物的作用下自行緩慢降解,其主要的限制在于養(yǎng)分供應(yīng)、電子受體/供體和污染物生物可利用性較低。因此采用生物刺激方式,針對(duì)性的添加適當(dāng)?shù)拇碳の锎龠M(jìn)土著微生物的繁殖和對(duì)污染物的利用,可能是一種成本更低、高效且環(huán)境友好的修復(fù)途徑[3, 8],并可調(diào)動(dòng)土壤本身具備的儲(chǔ)存和消除污染物的能力,促進(jìn)其整體生態(tài)功能的恢復(fù)[9]。目前已有眾多關(guān)于利用生物刺激進(jìn)行石油污染修復(fù)的研究,包括添加植物殘?bào)w[10-11]、堆肥[12-13]、禽畜糞便[14]和化學(xué)肥料[3, 15]等。其中,植物殘?bào)w是受到廣泛關(guān)注的一類刺激物和土壤調(diào)理劑。研究表明,添加植物殘?bào)w(如小麥秸稈、麥麩和玉米棒等)可以顯著增加油污土壤孔隙度,刺激好氣石油降解微生物的生長(zhǎng)并提高其活性,從而促進(jìn)污染物的降解[16]。多種糧食作物(如玉米、小麥和木薯)、經(jīng)濟(jì)作物(如核桃、甘蔗、大豆、油棕櫚、棉花、可可和大蕉)以及綠化植物(如各種行道樹和園林樹種)的殘?bào)w也可補(bǔ)充速效氮磷,提高磷酸酶和脲酶活性,從而減輕養(yǎng)分限制,促進(jìn)降解微生物生長(zhǎng)[12, 13, 16- 22]。同時(shí),添加上述殘?bào)w可誘導(dǎo)微生物氧化還原酶的分泌,從而加速石油烴、特別是毒性較大的芳香烴的去除[11, 16-17, 21]。然而,鑒于石油烴的降解和植物殘?bào)w自身分解均需要適量的養(yǎng)分供應(yīng),單純添加植物殘?bào)w修復(fù)油污土壤難以迅速刺激土著微生物生長(zhǎng),其有限的養(yǎng)分含量則可能導(dǎo)致其刺激作用隨養(yǎng)分消耗削弱,難以維持至絕大部分石油污染物降解和土壤功能恢復(fù)。因此,在使用植物殘?bào)w促進(jìn)石油污染土壤修復(fù)時(shí),有必要配合額外的養(yǎng)分輸入[23-24],以在最大程度上發(fā)揮植物殘?bào)w的生物刺激作用,強(qiáng)化其修復(fù)效果。目前,植物殘?bào)w與化學(xué)肥料聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤的研究尚少報(bào)道,且多數(shù)集中于測(cè)定修復(fù)后石油污染物的降解率以及上述處理對(duì)石油降解微生物和少數(shù)相關(guān)酶的影響,而較少考慮到與土壤功能密切相關(guān)的其他土壤生物學(xué)指標(biāo)的整體恢復(fù)?？紤]到油污土壤修復(fù)的最終目的是恢復(fù)土壤受損生態(tài)功能[9, 25],而單純的石油烴降解指標(biāo)難以反映土壤功能的恢復(fù)情況,因此有必要對(duì)植物殘?bào)w-化肥聯(lián)合處理后土壤酶、微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)以及土壤養(yǎng)分供給能力的恢復(fù)程度進(jìn)行全面研究,以評(píng)價(jià)聯(lián)合修復(fù)的效果。

陜北地區(qū)是我國(guó)重要的石油基地之一。較之其他石油產(chǎn)區(qū),陜北地區(qū)油氣資源分布相對(duì)分散,單井產(chǎn)量較低,導(dǎo)致產(chǎn)生了大量鉆井,加之由于歷史上的粗放管理,產(chǎn)生了大面積的嚴(yán)重石油污染,急需對(duì)污染土壤進(jìn)行修復(fù)以保護(hù)和恢復(fù)受損生態(tài)環(huán)境。因此,本文以當(dāng)?shù)貜V泛分布的紫花苜蓿(Medicagosativa)、鐵桿蒿(Artemisiagmelinii)和小冠花(Coronillavaria)3種草本植物為對(duì)象(其凋落物已被前期研究證明可顯著降低土壤石油烴含量),研究上述植物凋落物或凋落物-尿素聯(lián)合使用對(duì)嚴(yán)重石油污染土壤的生物學(xué)(11種酶和微生物數(shù)量)和化學(xué)性質(zhì)(速效養(yǎng)分含量)的全面恢復(fù)能力,以期為合理利用當(dāng)?shù)厣镔Y源,選擇適宜的凋落物或凋落物-施氮聯(lián)合形式加速當(dāng)?shù)匚廴就寥赖纳鷳B(tài)功能恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品采集及處理

試驗(yàn)用凋落物和土壤樣品均采集自延安市余家坪油田。具體方法是在油田附近未污染區(qū)采集紫花苜蓿、鐵桿蒿和小冠花的凋落物(紫花苜蓿和小冠花采集立枯體,鐵桿蒿采集其自然凋落的葉片和小枝)在60℃下烘干至恒重備用,其初始基質(zhì)質(zhì)量參照前期已發(fā)表數(shù)據(jù)(表1)。同時(shí),采集未污染土壤用于分析石油污染對(duì)土壤生物化學(xué)性質(zhì)的影響,該土壤為黃綿土,有機(jī)質(zhì)含量8.97 g/kg,pH為8.6,其余初始生化性質(zhì)見圖1—3。同時(shí),在不同油井附近選擇嚴(yán)重污染區(qū)域,收集0—20 cm表層污染土壤,統(tǒng)一過5 mm篩剔除雜物后混合均勻(經(jīng)實(shí)驗(yàn)室實(shí)測(cè)其污染物濃度為45.37 g/kg石油/干土),測(cè)定其生化性質(zhì)指標(biāo)用于初始污染對(duì)照,同時(shí)測(cè)定其含水率和田間飽和持水量后適當(dāng)風(fēng)干,用于后續(xù)調(diào)控實(shí)驗(yàn)過程中的土壤濕度。試驗(yàn)用尿素(分析純)購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司。

表1 凋落物初始質(zhì)量[26]

數(shù)據(jù)采用平均值(標(biāo)準(zhǔn)誤)表示,同列不同字母表示差異顯著,P<0.05

1.2 油污土壤修復(fù)試驗(yàn)及指標(biāo)測(cè)定

稱量4.0 kg的污染土壤18份平鋪至于規(guī)格為20 cm×30 cm×7 cm搪瓷盤內(nèi),按照凋落物/土壤2%的比例分別添加紫花苜蓿、鐵桿蒿和小冠花凋落物,混合均勻后形成微縮系統(tǒng),每種凋落物處理6盤。處理完成后,每種凋落物處理中的3盤使用噴霧器均勻噴施滅菌蒸餾水,調(diào)節(jié)土壤濕度至預(yù)先測(cè)定的田間飽和持水量的50%,其余3盤噴施含有尿素的滅菌蒸餾水,調(diào)節(jié)土壤濕度至于前述相同,土壤碳氮比約為25∶1。上述處理后,在搪瓷盤口覆蓋扎有30個(gè)2 mm通氣孔的保鮮膜以控制水分的劇烈蒸發(fā),并保證系統(tǒng)內(nèi)外氣體交換通暢。采用上述方法,將微縮系統(tǒng)在20—25℃條件下培養(yǎng)180 d。在此期間,定期通過稱量微縮系統(tǒng)質(zhì)量根據(jù)質(zhì)量損失補(bǔ)水,以維持土壤濕度基本恒定。試驗(yàn)結(jié)束后,將土壤過篩除去未分解的凋落物,根據(jù)關(guān)松蔭[27]、南京土壤研究所[28]和鮑士旦[29]的方法處理土樣,并用于土壤生化指標(biāo)測(cè)定。其中：蛋白酶采用茚三酮比色法；脲酶采用靛酚比色法；堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法；蔗糖酶、淀粉酶和羧甲基纖維素酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法；木聚糖酶采用碘量滴定法；過氧化氫酶活性采用滴定法；過氧化物酶和多酚氧化酶采用焦性沒食子酸比色法；脫氫酶采用三苯基四唑氯化物比色法測(cè)定[27]。微生物數(shù)量測(cè)定采用稀釋平板涂布法測(cè)定。其中細(xì)菌使用牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基,放線菌使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基(含1%重鉻酸鉀抑制細(xì)菌生長(zhǎng)),真菌使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[28]。堿解N、有效P和速效K分別采用堿解擴(kuò)散法、磷鉬藍(lán)比色法和火焰光度法測(cè)定[29]。處理后土壤總石油烴含量采用重量法測(cè)定[22],并據(jù)此計(jì)算降解率?？紤]到實(shí)驗(yàn)進(jìn)行短期內(nèi)石油烴的降解率較低,生化性質(zhì)恢復(fù)有限(本試驗(yàn)前期研究中僅可達(dá)到5%—6%[22]),本研究?jī)H測(cè)定了處理180 d后的生物學(xué)和化學(xué)指標(biāo),不再另行考慮自然降解180 d的情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,多重比較采用Tukey′s Test,顯著性檢驗(yàn)水平為α=0.05。使用SPSS 21.0對(duì)所有處理下土壤指標(biāo)較污染對(duì)照的提高率和石油烴降解率提高倍數(shù)做主成分分析,以獲得的綜合主成分值F作為修復(fù)能力排序的參考標(biāo)準(zhǔn)。其數(shù)值越大,表明對(duì)應(yīng)處理的綜合修復(fù)效果越強(qiáng)。使用SIMCA-P 14.0軟件對(duì)各處理特征(凋落物基質(zhì)質(zhì)量指標(biāo)以及是否配合施氮)與修復(fù)后土壤生化指標(biāo)的提高率做偏最小二成回歸分析,根據(jù)各種凋落物性質(zhì)和施氮指標(biāo)對(duì)每種土壤生化指標(biāo)的變量投影重要值判定影響特定土壤指標(biāo)的主要因素。一般要求選取的因素的VIP值大于1,鑒于本研究影響因素中含有兩類,因此選取VIP值明顯高于其他的因素作為主要因素。繪圖采用SigmaPlot 12.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理對(duì)土壤生物學(xué)和化學(xué)性質(zhì)以及石油烴降解的影響

研究結(jié)果表明,重度石油污染將顯著降低土壤可培養(yǎng)細(xì)菌(含放線菌)和真菌數(shù)量(P<0.05,圖1)。凋落物單獨(dú)處理6個(gè)月使油污土壤細(xì)菌再次顯著降低,但均顯著提高放線菌和真菌數(shù)量,甚至使放線菌數(shù)量較未污染土壤顯著提高(P<0.05)。其中,紫花苜蓿凋落物對(duì)放線菌生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最顯著,而小冠花凋落物對(duì)真菌生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最顯著。絕大多數(shù)情況下,配合施氮對(duì)凋落物處理的效果無顯著影響,其僅顯著削弱了紫花苜蓿凋落物對(duì)放線菌生長(zhǎng)的刺激作用(P<0.05)。

圖1 草本凋落物與尿素處理后土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量Fig.1 Soil culturable microbial populations in petroleum-contaminated soils treated with grass litters with or without urea application數(shù)據(jù)采用平均值/標(biāo)準(zhǔn)誤(誤差線)表示,同列不同字母表示差異顯著,P<0.05; P<0.05; Uncontaminated: 未污染; Contaminated: 污染土壤; M.s litter: 苜蓿凋落物; M.s litter+urea: 苜蓿凋落物+尿素; A.g litter: 鐵桿蒿凋落物; A.g litter+urea: 鐵桿蒿凋落物+尿素; C.v litter: 小冠花凋落物; C.v litter+urea: 小冠花凋落物+尿素

研究結(jié)果表明,重度石油污染將顯著抑制除堿性磷酸酶、過氧化氫酶和脫氫酶外的8種酶的活性(圖2)。凋落物單獨(dú)處理6個(gè)月后,除對(duì)脫氫酶活性均產(chǎn)生抑制外,對(duì)蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性均有顯著刺激作用(P<0.05),3種凋落物中,鐵桿蒿凋落物對(duì)受抑土壤酶活性的刺激效果,特別是對(duì)淀粉酶、磷酸酶和多酚氧化酶活性的提高效果相對(duì)較差。一些情況下,配合施氮可顯著增強(qiáng)凋落物對(duì)蔗糖酶、纖維素酶、磷酸酶、多酚氧化酶和過氧化物酶活性的恢復(fù),但對(duì)木聚糖酶、脲酶、蛋白酶和脫氫酶等酶則產(chǎn)生顯著抑制(P<0.05)。

圖2 草本凋落物與尿素處理后土壤酶活性Fig.2 Enzymes activities of petroleum-contaminated soils treated with grass litters with or without urea application數(shù)據(jù)采用平均值/標(biāo)準(zhǔn)誤(誤差線)表示,同列不同字母表示差異顯著,P<0.05。Data were presented as mean (SE), different letters after the data in the same column indicate significant differences, P<0.05. SUC: 蔗糖酶 Sucrase; AMY: 淀粉酶 Amylase; CMC: 羧甲基纖維素酶 Carboxymethyl cellulase; XYL: 木聚糖酶 Xylanase; URE: 脲酶 Urease; PRO: 蛋白酶 Protease; AP: 堿性磷酸酶 Alkaline phosphatase; PPO: 多酚氧化酶 Polyphenol oxidase; CAT: 過氧化氫酶 Catalase; POD: 過氧化物酶 Peroxidase; DEH: 脫氫酶 Dehydrogenase

重度石油污染將顯著降低土壤速效N、P和K含量(圖3)。凋落物單獨(dú)處理6個(gè)月后,土壤速效養(yǎng)分含量均有顯著提高(P<0.05),其中兩種豆科植物凋落物的修復(fù)效果相似,而鐵桿蒿凋落物對(duì)土壤堿解N和速效K的恢復(fù)效果顯著低于豆科凋落物(P<0.05)。配合施氮均可顯著增強(qiáng)凋落物對(duì)土壤速效養(yǎng)分的修復(fù)能力(P<0.05)。

經(jīng)180 d處理后,較之自然降解,3種凋落物處理均大幅降低了污染土壤的總石油烴含量,其中鐵桿蒿凋落物處理降解石油烴的能力顯著(P<0.05)強(qiáng)于紫花苜蓿和小冠花凋落物(表2)。配合施氮可增強(qiáng)凋落物對(duì)石油烴的去除能力(表2),使其降解率顯著提高了11.27%—17.31%。

圖3 草本凋落物與尿素處理后土壤養(yǎng)分含量Fig.3 Nutrient contents of petroleum-contaminated soils treated with grass litters with or without urea application數(shù)據(jù)采用平均值/標(biāo)準(zhǔn)誤(誤差線)表示,同列不同字母表示差異顯著,P<0.05; SAK: 土壤堿解氮 Soil alkeline N content; SAP: 土壤有效磷 Soil available P content; SAK: 土壤速效鉀 Soil available K content

表2 處理后土壤總石油烴含量

Table 2 Total petroleum hydrocarbon contents of petroleum-contaminated soils treated with grass litters with or without urea application

處理Treatments自然降解180 dNatural degradation for 180 d紫花苜蓿凋落物M. sativa litter紫花苜蓿凋落物+尿素M. sativalitter + urea鐵桿蒿凋落物A. gmeliniilitter鐵桿蒿凋落物+尿素A. gmeliniilitter + urea小冠花凋落物C. varialitter小冠花凋落物+尿素C. varialitter + urea降解率 Degradation rate/%7.66(0.29)d59.37(3.75)c76.68(0.75)a65.60(1.71)b81.14(1.06)a56.03(0.86) c67.30(0.98)b

數(shù)據(jù)采用平均值(標(biāo)準(zhǔn)誤)表示,同行不同字母表示差異顯著,P<0.05各處理綜合改良作用及處理因素對(duì)土壤指標(biāo)的影響

圖4 不同處理對(duì)污染土壤生物化學(xué)性質(zhì)的綜合影響Fig.4 The integrated remediation effects of different treatments on the biochemical properties of contaminated soilUncontaminated: 未污染; Contaminated: 污染土壤; M.s litter: 苜蓿凋落物; M.s litter+urea: 苜蓿凋落物+尿素; A.g litter: 鐵桿蒿凋落物; A.g litter+urea: 鐵桿蒿凋落物+尿素; C.v litter: 小冠花凋落物; C.v litter+urea: 小冠花凋落物+尿素

2.2 各處理綜合改良作用及處理因素對(duì)土壤指標(biāo)的影響

綜合主成分分析結(jié)果表明(圖4),基質(zhì)質(zhì)量較高的凋落物對(duì)油污土壤的修復(fù)能力更好,配合施氮均可顯著提高凋落物的修復(fù)能力。對(duì)多數(shù)土壤指標(biāo)而言,是否配合外源N添加是影響其較對(duì)照提高率的最重要因素(圖5),配合施氮對(duì)于污染土壤中蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶、磷酸酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶和過氧化物酶活性以及堿解N、有效P和速效K含量的恢復(fù)均具有積極效果,且有利于總石油烴的降解,而對(duì)木聚糖酶、脲酶、脫氫酶活性以及放線菌和真菌的數(shù)量恢復(fù)均產(chǎn)生不利影響。凋落物基質(zhì)質(zhì)量中,較高的葉源N或P絕對(duì)含量更有利于蔗糖酶、淀粉酶、纖維素酶活性和真菌數(shù)量的恢復(fù)以及石油烴的降解,較好的分解和養(yǎng)分供應(yīng)特性(低C/N和C/P)更有利于脲酶、磷酸酶等養(yǎng)分循環(huán)酶,多酚氧化酶和脫氫酶等石油降解酶活性以及真菌數(shù)量的恢復(fù),較低的木質(zhì)素和多酚含量也有利于土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量的恢復(fù)以及石油烴的降解。

3 討論與結(jié)論

本研究表明,重度石油污染將顯著降低可培養(yǎng)土壤微生物數(shù)量,這與Eze等[4]的研究結(jié)果相符。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因除石油污染物對(duì)微生物的直接毒性作用外,也與石油進(jìn)入土壤后微生物生存環(huán)境的惡化,如通氣性和持水能力的下降和氮磷養(yǎng)分的相對(duì)匱乏[30- 33]有關(guān)。大量研究表明,添加生物刺激物往往可以通過補(bǔ)充養(yǎng)分、增加電子受體和提高污染物的生物可利用性促進(jìn)污染物的降解和微生物的生長(zhǎng)[3, 8, 34-35]。本研究中,凋落物處理顯著提高了油污土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌中的放線菌類群以及真菌的數(shù)量,這與于齊等[22]和Zhang等[36]關(guān)于凋落物處理促進(jìn)油污土壤微生物生長(zhǎng)的研究結(jié)果相似。此外,利用16SrDNA和16SrRNA鑒定等技術(shù)的研究[10, 18]也表明植物殘?bào)w處理可顯著提高污染土壤的細(xì)菌總豐度和放線菌門豐度。凋落物提高土壤微生物數(shù)量原因可能是其分解可以快速釋放出易于微生物利用的氮磷養(yǎng)分[20, 37],從而解除養(yǎng)分限制促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。本研究中兩種含氮較高的豆科凋落物較之鐵桿蒿凋落物促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的效果更好也支持了上述假設(shè)。同時(shí),凋落物中含有大量的纖維木質(zhì)素成分,使得其在分解過程中能夠維持一定形狀,且凋落物具有一定的吸水能力[38],上述特征使其與土壤混合后,可以在一定程度上改善土壤的孔隙狀況和保水能力[11, 16],從而改善微生物的生存環(huán)境使其數(shù)量得以恢復(fù)。此外,上述作用均可促進(jìn)石油污染物的降解(表2),從而降低其毒性和對(duì)土壤理化性質(zhì)的干擾,使微生物數(shù)量反饋增加[8, 10]。然而,與其他研究[10, 18-19]相反,本研究中凋落物處理6個(gè)月后,土壤細(xì)菌數(shù)量并未恢復(fù),甚至較油污土壤降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)。其原因可能是凋落物分解后養(yǎng)分供給能力顯著降低,因此大量石油污染物引起的養(yǎng)分限制在試驗(yàn)后期重新出現(xiàn)。支持上述假設(shè)的依據(jù)是前期研究表明在修復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行1個(gè)月時(shí)細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量均有顯著提高(未發(fā)表數(shù)據(jù)),而至試驗(yàn)后期凋落物已經(jīng)無法提供更多有效養(yǎng)分(鐵桿蒿凋落物N釋放已達(dá)約50%,豆科凋落物可達(dá)88%左右,3種凋落物的P釋放均已達(dá)90%以上,未發(fā)表數(shù)據(jù))。其次,修復(fù)過程中土著降解菌的活動(dòng)將顯著降解大量石油烴,然而石油烴的某些降解產(chǎn)物仍具有強(qiáng)烈的生物毒性[9],除放線菌外細(xì)菌類群對(duì)這些中間產(chǎn)物的耐受能力可能相對(duì)較差,導(dǎo)致其數(shù)量顯著降低。與單純使用凋落物處理相比,配合施氮對(duì)微生物數(shù)量的恢復(fù)并無更佳效果,這與Roy等[15]和Ramirez等[39]的研究結(jié)果不符。一般認(rèn)為施氮可以提供大量養(yǎng)分,有利于微生物數(shù)量的恢復(fù),因此本研究中配合施氮對(duì)微生物無影響的原因可能是施用的尿素量較小,未能調(diào)節(jié)土壤到適宜的養(yǎng)分比例(本研究中為25∶1,而適宜量約為10∶1,Varjani和Upasani[1]),因此其促進(jìn)作用相對(duì)有限。需要說明的是,受限于平板計(jì)數(shù)技術(shù)中可培養(yǎng)微生物種類的限制,本研究在一定程度上對(duì)處理后微生物豐度存在低估(如本研究中凋落物處理對(duì)細(xì)菌數(shù)量影響不顯著但其他研究中細(xì)菌總豐度有小幅上升[10, 18]),且單純考慮各處理對(duì)可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響對(duì)評(píng)價(jià)土壤功能的恢復(fù)尚不足夠,在后續(xù)研究中,尚需采用高通量測(cè)序和Biolog等[35]技術(shù)進(jìn)一步研究凋落物及其與尿素聯(lián)合使用對(duì)細(xì)菌/真菌豐度、活性、功能多樣性、代謝特征和群落結(jié)構(gòu)的影響,以深入分析上述處理對(duì)土壤功能恢復(fù)的具體作用。當(dāng)然,從本研究中在可培養(yǎng)微生物數(shù)量恢復(fù)有限甚至有所降低的情況下,仍檢測(cè)到多種執(zhí)行不同土壤功能的酶的活性普遍顯著提高而總石油烴含量降低的現(xiàn)象推測(cè)(圖2和表2),凋落物處理和凋落物-尿素聯(lián)合處理應(yīng)該在一定程度上增加了油污土壤中微生物的多樣性和活性,并可能增加了其中石油烴降解菌的比例。Shahsavari等[10]關(guān)于豌豆秸稈處理顯著增加油污土壤細(xì)菌多樣性,Al-Kindi和Abed[18]關(guān)于豆粕和麥秸等植物殘?bào)w對(duì)污染土壤細(xì)菌豐度影響不顯著但使厚壁菌門、γ和δ變形菌綱的比例顯著增加,以及Roy等[15]關(guān)于氮素添加顯著提高細(xì)菌α多樣性和細(xì)胞活力以及厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和綠彎菌門等降解菌比例的結(jié)果均支持了上述推測(cè)。此外,長(zhǎng)期處理后土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性是否可以恢復(fù)到近似未污染土壤的水平也尚需進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

圖5 凋落物性質(zhì)和外源氮(尿素)對(duì)土壤性質(zhì)改良程度的變量投影重要性指標(biāo)Fig.5 The variable importance in projection (VIP) values as affected by litter characteristics and exogenous N (urea) in petroleum-contaminated soils 實(shí)心點(diǎn)代表正效應(yīng),空心點(diǎn)代表負(fù)效應(yīng);LitterN: 凋落物氮含量 Content of litter N; LitterP: 凋落物氮含量 Content of litter P; CNR: 凋落物碳氮比 C/N ratio of litter; CPR: 凋落物碳磷比 C/P ratio of litter; Ployphenols: 多酚含量 Contents of polyphenols; Lignin: 木質(zhì)素含量 Contents of lignin; ExogenousN: 外源N; Degradation: 石油烴降解率

除抑制微生物生長(zhǎng)外,石油污染也將顯著抑制土壤酶活性[6-7, 40]。本研究中,除堿性磷酸酶、過氧化氫酶和脫氫酶外的8種酶的活性均受到顯著抑制,這與上述研究結(jié)果相同。其原因可能是石油污染顯著抑制了微生物的生長(zhǎng),導(dǎo)致酶活性因微生物死亡下降,同時(shí)污染物覆蓋于酶或酶-礦物質(zhì)復(fù)合體表面,阻止其與底物接觸或直接改變其分子結(jié)構(gòu)破壞其功能[41-42]。凋落物添加可顯著恢復(fù)土壤酶活性,這與前人研究結(jié)果類似[22- 23, 36]。其恢復(fù)途徑可能有以下幾種：首先,促進(jìn)微生物的生長(zhǎng),從而增加胞內(nèi)酶數(shù)量和胞外酶分泌,或在微生物死亡后增加酶的釋放量,因而提高土壤酶活性。其次,通過促進(jìn)石油污染物的降解逐漸恢復(fù)微生物的群落結(jié)構(gòu),恢復(fù)多種土壤酶的分泌。此外,凋落物可提供較易分解的有機(jī)質(zhì)(糖類、氨基酸、纖維素等)或石油烴共代謝底物(木質(zhì)素分解中間產(chǎn)物和酚類)等,誘導(dǎo)相應(yīng)酶的產(chǎn)生和活性提高[8, 21]。最后,凋落物自身分解和轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的腐殖酸類物質(zhì)或其促進(jìn)放線菌類微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的生物表面活性劑可增加石油污染物的移動(dòng)性[18, 34-35],減少其對(duì)酶的覆蓋增加其與底物的接觸,從而表現(xiàn)出酶活性的提高。配合施氮對(duì)油污土壤酶活性的影響較為多樣,對(duì)不同酶活性表現(xiàn)為顯著促進(jìn)和顯著抑制,這與Burns等[43]、Kim和Kang[44]、Song等[45]和Janssens等[46]關(guān)于氮輸入對(duì)土壤酶活性的影響的研究結(jié)果相一致。其原因可能是施氮一方面提供了大量氮素促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng),但另一方面則導(dǎo)致新的養(yǎng)分平衡改變(N過剩而P相對(duì)匱乏),誘導(dǎo)產(chǎn)生微生物群落結(jié)構(gòu)或功能特性的改變[47- 49]。例如,大量易獲得的N的添加促進(jìn)了微生物生長(zhǎng)及其對(duì)易分解C源和石油組分的利用,并迫使微生物分泌磷酸酶以獲取P素,表現(xiàn)為蔗糖酶、纖維素酶、磷酸酶、多酚氧化酶和過氧化物酶等活性的顯著提高,而其N素供應(yīng)的充足和易于利用則導(dǎo)致土壤脲酶和蛋白酶等活性的降低。

與前人研究結(jié)果一致[32-33],石油污染將顯著降低土壤速效養(yǎng)分含量,而凋落物添加將顯著提高油污土壤的堿解N、有效P和速效K含量[22-23, 36]。凋落物分解直接釋放養(yǎng)分對(duì)土壤養(yǎng)分的補(bǔ)充可以部分解釋上述現(xiàn)象,但鑒于凋落物所含有的N、P和K都相對(duì)有限,因此凋落物處理對(duì)土壤速效養(yǎng)分含量的補(bǔ)充可能主要是通過恢復(fù)微生物群落結(jié)構(gòu),從而恢復(fù)受到抑制的氨化、硝化作用和脫磷酸作用等生物轉(zhuǎn)化過程[32-33],增加土壤速效養(yǎng)分含量。此外,石油降解過程中的pH降低可能也是土壤養(yǎng)分有效性提高的原因之一[50-51]。配合施氮顯著提高了凋落物添加對(duì)土壤速效養(yǎng)分的補(bǔ)充能力,其對(duì)堿解氮含量的顯著提高絕大部分歸因于其直接補(bǔ)充作用,而其對(duì)有效磷和速效鉀含量的提高作用可能是由于其如前所述,能顯著提高石油烴降解率和土壤微生物的活性,并改變土壤生化環(huán)境,促進(jìn)難利用養(yǎng)分的活化和釋出。

實(shí)測(cè)結(jié)果(圖1—3)以及后續(xù)綜合主成分分析(圖4)和偏最小二乘回歸(圖5)結(jié)果表明,添加凋落物配合施氮較之單獨(dú)使用凋落物對(duì)土壤生化指標(biāo)的總體恢復(fù)效果更明顯,與凋落物基質(zhì)質(zhì)量相比,是否配施外源氮是各處理中對(duì)石油烴降解、7種酶、速效養(yǎng)分含量和放線菌影響最大的因素,說明N的供應(yīng)可能是限制油污土壤生化性質(zhì)自行恢復(fù)主要限制因素之一。然而,雖然配合施氮的總體修復(fù)能力更好,其仍然存在對(duì)若干土壤酶活性和微生物數(shù)量產(chǎn)生不利影響的可能性,其較好的整體修復(fù)效果可能更多來自于對(duì)少數(shù)指標(biāo)的大幅提高(圖1—圖3)。實(shí)測(cè)結(jié)果(圖1—圖3)和PAC分析(圖4)表明3種凋落物中,兩種豆科植物凋落物的總體修復(fù)效果較之鐵桿蒿凋落物更好。PLSR結(jié)果(圖5)也表明,凋落物性質(zhì)中較高N、P絕對(duì)含量、較好的分解和養(yǎng)分釋放潛力以及較低的酚類和木質(zhì)素含量有利于土壤易分解有機(jī)質(zhì)降解、養(yǎng)分循環(huán)和難分解有機(jī)質(zhì)和石油烴降解、以及支持微生物生長(zhǎng)等土壤功能的恢復(fù),也即基質(zhì)質(zhì)量更好的凋落物可以較為全面的恢復(fù),這與前人研究結(jié)果相似[8]?；谏鲜龇治?本文建議在采用生物刺激方式修復(fù)重度污染土壤時(shí),應(yīng)盡量采用基質(zhì)質(zhì)量較高的凋落物作為調(diào)理劑,以更為全面地修復(fù)土壤功能。在急需迅速修復(fù)土壤的條件下,配合適量施氮是提高凋落物修復(fù)效果的有效手段之一,但應(yīng)注意其導(dǎo)致的部分土壤生化指標(biāo)修復(fù)能力的降低。