姜辰昊 高增明 王 偉 孫天穎 余世鋒 王存堂

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

玉米淀粉是可利用的最廉價的淀粉，因其具有較好的流變和凝膠特性，通常在糊化后被用作增稠劑、黏合劑、穩(wěn)定劑等[1, 2]。然而糊化后的淀粉在降溫過程中易發(fā)生回生現(xiàn)象，導(dǎo)致淀粉類產(chǎn)品在存儲期間出現(xiàn)硬度增加、黏度降低、抗酸解、脫水等回生現(xiàn)象，促使其品質(zhì)變劣、貨架期縮短[3]。因此在工業(yè)上，淀粉要經(jīng)過各種物理或化學(xué)改性以防止回生。物理改性法主要包括濕熱處理、擠壓、微波和高靜水壓處理等方法，然而這些物理方法一般成本較高，不適宜大規(guī)模應(yīng)用；化學(xué)修飾法主要包括對淀粉進(jìn)行乙?；?、琥珀?；约傲姿峄确椒?，但是許多用于食品的化學(xué)修飾對人體健康不夠安全[4]。因此，研究大多采用抗淀粉回生的食品添加劑，如黃原膠、環(huán)糊精、海藻酸鈉，與淀粉溶液混合其親水性端插入直鏈淀粉分子形成螺旋配合體，影響淀粉分子重排微環(huán)境，從而延緩淀粉重結(jié)晶，達(dá)到抑制回生的目的[3-5]。在淀粉糊化的過程中，小分子糖能夠隨水滲透并進(jìn)入淀粉內(nèi)部，達(dá)到抑制淀粉回生的目的[6]。此外，將原花青素、茶多酚等多酚類物質(zhì)添加到淀粉中，也可有效抑制回生作用，其原因可能是淀粉和酚類化合物的羥基形成氫鍵，從而干擾貯存過程中淀粉多聚物鏈自身的結(jié)合所致[7, 8]。

洋蔥中多酚類物質(zhì)含量極為豐富，其成分主要是黃酮類、黃酮醇類和花色素類等[9]。洋蔥外皮中黃酮類物質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于內(nèi)部鱗莖，并且洋蔥皮乙醇提取物可達(dá)10%[10, 11]。目前對洋蔥黃酮類物質(zhì)的研究集中在抗氧化成分結(jié)構(gòu)鑒定、抗氧化活性、抗菌活性評價以及抗慢性退行性疾病方面。已有研究表明含有多羥基結(jié)構(gòu)的茶多酚、原花青素對玉米淀粉的回生過程有顯著的抑制效果，然而洋蔥皮中黃酮類物質(zhì)作為洋蔥提取物中的主要生物活性成分，也是含有多羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類成分，其提取物對淀粉回生的影響研究鮮見報道。因此，本實驗研究EEOS對玉米淀粉回生的影響，采用差示掃描量熱儀、傅里葉紅外光譜儀、X-射線衍射和掃描電鏡探究EEOS與玉米淀粉的相互作用，并研究EEOS對淀粉體外消化性的影響，分析EEOS對玉米淀粉回生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色洋蔥外皮：齊齊哈爾農(nóng)貿(mào)市場；玉米淀粉：市售；α淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(100 000U/g)；無水醋酸鈉、冰醋酸、3，5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、重苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸鈉均為分析純。

2.5L freezePrysystem真空冷凍干燥機；STA449F3 同步熱分析儀；Specdrum-100紅外光譜儀；Ultima IV型 X射線衍射儀；S-3400掃描電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 洋蔥皮乙醇提取物(EEOS)的制備

稱取洋蔥皮300 g進(jìn)行粉碎，加入600 mL，70%乙醇浸提2 h后，過濾取濾液。將濾渣再次進(jìn)行上述提取過程，合并兩次濾液。將濾液在50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后經(jīng)冷凍干燥后的粉末即EEOS，將EEOS在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 淀粉樣品的制備

取玉米淀粉 10 g，分別加 入 0%、2.5%、5%、10%的EEOS混合, 加水配制淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%樣品，在121 ℃下糊化20 min。將糊化后樣品放入4 ℃冰箱內(nèi)分別貯存 0、5、10、15 d后，將樣品凍干后研磨，過120目篩后，備用。

1.2.3 回生玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)測定

采用差式掃描量熱儀(DSC)對回生玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定[12]。在使用DSC前，用標(biāo)準(zhǔn)銦進(jìn)行校準(zhǔn)。取2～3 mg樣品放在鋁制坩堝中，用微量進(jìn)樣器加入4～6 μL的蒸餾水后壓樣并平衡24 h，以空坩堝做對照，升溫范圍為20～200 ℃，載氣為氮氣，從DSC熔融曲線中讀取起始溫度T0，峰值溫度Tp，及終止溫度Tc。通過Origin 8.5軟件進(jìn)行積分計算各個樣品的糊化焓值。

1.2.4 回生玉米淀粉的紅外光譜測定[13]

采用傅里葉紅外光譜儀對回生15 d的玉米淀粉樣品進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取1 mg 樣品與150 mg KBr 進(jìn)行混合，充分研磨壓片制樣，進(jìn)行紅外光譜掃描，測量范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為16次，分辨率4 cm-1。

1.2.5 回生玉米淀粉XRD射線衍射的測定[14]

采用全自動X射線衍射儀對回生15 d的玉米淀粉進(jìn)行晶型進(jìn)行掃描，采用銅靶測定，條件為：電壓40 kV，衍射角的旋轉(zhuǎn)范圍為5°～30°，掃描速度為2.0(°)/min，步長0.02°，結(jié)果用Origin 8.5進(jìn)行積分計算相對結(jié)晶度。

1.2.6 回生玉米淀粉顆粒電鏡掃描

對回生15 d的玉米淀粉樣品進(jìn)行電鏡掃描。掃描電壓 10.00 kV，電流 64.0 μA。將不同的樣品做好記錄，平穩(wěn)地固定于直徑1.0 cm的樣品臺上，噴金鍍膜，在掃描電子顯微鏡下，分別用800、10 000的放大倍數(shù)從不同角度進(jìn)行觀察拍照[15]。

1.2.7 回生玉米淀粉體外消化能力測定[16]

混合酶液的配制：稱取糖化酶(100 000 U/g)2 g和α淀粉酶溶液(20 000 U/mL)5 mL同時溶于100 mL蒸餾水中離心取上清液即為混合酶液。

稱取淀粉樣品100 mg，加入pH5.2的醋酸緩沖溶液25 mL，37 ℃水浴5 min，加入5 mL預(yù)熱好的混合酶溶液，在540 nm下測20 min和120 min吸光度值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程式為y=1.613 4x-0.083 2，R2=0.999 1，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算淀粉在20 min和120 min生成還原糖的含量[16]。

快消化淀粉(RDS)=[(G20-FG)/TS]×0.9×100%

慢消化淀粉(SDS)=[(G120-G20)/TS]×0.9×100%

抗性淀粉(RS)=[(TS-G120)/TS]×0.9×100%

式中：G20為酶水解20 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖質(zhì)量/mg；G120為酶水解120 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；TS為樣品中總淀粉含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的平均值，所有實驗結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS11.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析和相關(guān)性分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EEOS對玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)的影響

淀粉的熔融焓值(ΔH)代表在與水共熱的條件下，解開淀粉分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)能量的大小，其本質(zhì)是親水性的羥基基團與支鏈淀粉的側(cè)鏈相互作用，并在不同程度上結(jié)合到淀粉顆粒的無定形區(qū)域，從而改變結(jié)晶區(qū)和無定形基質(zhì)之間的耦合力[16]。由表1可知，隨著回生時間的延長，ΔH逐漸增加；且EEOS的添加對玉米淀粉的ΔH的影響是顯著的，且隨著濃度的增加玉米淀粉的ΔH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。添加EEOS的添加量為2.5%，在回生5 d后，玉米淀粉的ΔH比對照組降低了29.77%，抑制回生的效果最好。這可能是因為黃酮類物質(zhì)的多-OH 結(jié)構(gòu)有關(guān)，-OH 具有很強的親水性可以與淀粉的側(cè)鏈結(jié)合，不同程度鍵合到淀粉的無定形區(qū)域，致使淀粉糊化時ΔH降低。而添加 10% EEOS，玉米淀粉回生5 d后，其ΔH僅下降了15.26%，這可能是由于EEOS與玉米淀粉結(jié)合進(jìn)一步增強，形成穩(wěn)定的聚集結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致回生過程淀粉結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變所需能量增多。此外還需指出的是，采用乙醇作為提取溶劑，其提取物中乙醇的殘留，也可作為羥基的供體，參與淀粉的回生抑制過程。在乙醇提取過程中的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)操作，導(dǎo)致提取物中的乙醇含量較低，其所含有的羥基對淀粉回生效果的抑制可能會很小，因此在研究中，盡量降低乙醇的殘留量，減少對實驗結(jié)果的影響。

表1 不同濃度的EEOS對回生玉米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)的影響

注：結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3), 同一列中字母不同表示差異顯著(P<0.05)，余同。

2.2 EEOS對玉米淀粉紅外光譜的影響

將糊化后的淀粉儲存在較低的溫度下，由于其處于熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)，無序的支鏈淀粉鏈重新定向排列、內(nèi)部水分逐漸喪失，從無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行蚪Y(jié)構(gòu)，且分子間結(jié)構(gòu)越有序，淀粉回生程度越大[17]。Goodfellow 等[18]通過對淀粉結(jié)構(gòu)分析指出可以用紅外光譜 800～1 200 cm-1之間吸光度比值表征淀粉的短程有序性，其中1 022 cm-1處與淀粉無定形區(qū)域相關(guān)，而 1 047 cm-1與淀粉有序程度相關(guān)。Flores 等[19]用吸收峰1 047/1 022 處吸光度比值來確定結(jié)晶區(qū)域的有序性，因此1 047/1 022吸光度的比值可以代表淀粉回生程度的大小。EEOS對玉米淀粉回生性質(zhì)影響的紅外光譜如圖1所示。

圖1 EEOS添加量對玉米淀粉紅外光譜的影響(回生15d)

從表2可知，在添加不同濃度EEOS時，回生15 d的玉米淀粉在1 047/1 022處表征的吸光度值均有所下降，表明EEOS可抑制玉米淀粉的回生。而添加2.5%的EEOS玉米淀粉1 047/1 022吸光度的比值與對照組相比，下降了約6.31%，說明添加2.5%的EEOS對玉米淀粉回生有較好的抑制效果。

表2 EEOS添加量對1 047/1 022比值的影響(回生15 d)

2.3 EEOS對玉米淀粉重結(jié)晶情況的影響

淀粉的回生過程是糊化的可逆過程，糊化后的淀粉分子在低溫下自動排列成序，相鄰分子間的氫鍵又逐步恢復(fù)形成致密、高度晶化的分子微束[7]。在回生過程中，隨著時間的延長，回生程度隨之增大，結(jié)晶度也隨之增加[17]。XRD 分析測定的是不同EEOS添加量時玉米淀粉樣品在回生后的最終重結(jié)晶情況(圖2)。而當(dāng)?shù)矸刍厣螅?6.9°處有很強的吸收峰，這是B-型結(jié)晶典型的特征[17]。當(dāng)添加不同濃度的EEOS后，淀粉回生樣品在16.9°處的衍射強度均有所下降，說明EEOS的添加可有效抑制玉米淀粉的的回生。這可能是由于黃酮類物質(zhì)含有大量的羥基，可以通過非共價相互作用與直鏈淀粉或者支鏈淀粉的部

圖2 EEOS添加量對回生玉米淀粉XRD射線 衍射圖的影響(回生15 d)

分分支之間發(fā)生相互作用，限制了淀粉分子之間的重結(jié)晶，從而抑制淀粉的回生過程[20]。

此外，根據(jù)表3中淀粉相對結(jié)晶度的結(jié)果可以看出，添加不同濃度的EEOS的淀粉相對結(jié)晶度均有所下降。添加2.5%的EEOS的淀粉相對結(jié)晶度比對照組下降了2.95%，但是添加量增大到5%和10%時，回生淀粉樣品的相對結(jié)晶度反而高于添加量為2.5%時的樣品，說明EEOS的添加量對淀粉回生的抑制作用并沒有濃度依賴關(guān)系，添加量為2.5%時可達(dá)到較好的抑制回生的效果。

表3 EEOS添加量對玉米淀粉相對結(jié)晶度的影響(回生15 d)

2.4 EEOS對回生玉米淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過電鏡掃描可以從微觀層面觀察EEOS對玉米淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)所造成的影響，結(jié)果如圖3所示。在回生15d后，對照組的玉米淀粉表面是不規(guī)則的粗糙多孔結(jié)構(gòu)。而加入2.5%的EEOS的淀粉表面結(jié)構(gòu)平整，粗糙度降低。這可能是由于冷藏條件下的回生玉米淀粉，在冷凍干燥時水分升華，對照組的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)就是由于孔洞內(nèi)水分損失造成的。而添加EEOS的淀粉分子的羥基與提取物中的含有大量羥基的黃酮類物質(zhì)的羥基形成氫鍵，從而在冷凍升華干燥后仍然能夠保持較為光滑的表面形態(tài)[15]。

圖3 EEOS對回生玉米淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.5 EEOS對玉米淀粉體外消化的影響

根據(jù)在人體消化道內(nèi)消化速率的差異，淀粉分為3類，快消化淀粉(RDS) 、慢消化淀粉(SDS) 和抗性淀粉(RS)。快消化淀粉指的是20 min內(nèi)淀粉在體內(nèi)生成還原糖的含量，慢消化淀粉指的是在120 min內(nèi)淀粉在體內(nèi)生成還原糖的含量，抗性淀粉指的是不能被淀粉酶水解的淀粉含量[21]。

表4 不同濃度的EEOS對回生淀粉的體外消化性質(zhì)的影響

由表4可知，隨著的回生時間的延長，玉米淀粉中RDS含量逐漸下降，SDS和RS含量逐漸增加，說明淀粉在4 ℃儲存的過程中回生程度的增加也會導(dǎo)致消化性逐漸變差。EEOS添加量為2.5%和5%時，回生5 d 的玉米淀粉的RDS含量下降分別為21.36%和33.22%，但當(dāng)EEOS添加量為10%時與添加量為5%相比，RDS含量差異不顯著(P>0.05)。同時，與對照組相比，EEOS的添加，導(dǎo)致玉米淀粉中RS的含量顯著增加(P<0.05)，添加量5%和10%的樣品對比則沒有顯著差異(P>0.05)。這可能由于EEOS中的黃酮類物質(zhì)含有較多的氫鍵，玉米淀粉顆粒表面被黃酮類成分的多羥基結(jié)構(gòu)緊緊包圍，減少了酶對淀粉消化作用的表面積[21]，從而阻止酶對淀粉的水解位點所致。同時，EEOS添加量10%時，并沒有顯著導(dǎo)致RDS含量的增加和RS含量的下降，也可能是因為EEOS的添加量為5%時已達(dá)到飽和效果，過量的添加對消化程度的抑制并不顯著。韋冷云[22]也發(fā)現(xiàn)向淀粉中添加一定比例的菊糖，淀粉的水解率會有一定程度的降低。

3 結(jié)論

將EEOS(富含黃酮類物質(zhì))添加到玉米淀粉中，其回生焓值、相對結(jié)晶度、1 047/1 022的比值均顯著降低，回生后的玉米淀粉微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，均說明EEOS對玉米淀粉的回生有抑制作用。EEOS的添加量對回生的抑制程度有顯著影響，添加2.5%的對回生的抑制效果較好。此外，EEOS的添加，促使玉米淀粉的消化體外消化性能下降，RDS含量下降、RS含量增加。