曹順順， 汪曉龍， 舒?zhèn)骼^， 邵劍杰

鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，湖北 黃石（435002）

舌鱗癌是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一，與口咽癌位列全身惡性腫瘤的第6 位［1-2］。舌鱗癌的發(fā)病原因尚未明確，但是研究表明，吸煙、嗜酒等因素與舌鱗癌的發(fā)生有關(guān)［3］。目前臨床上對于舌鱗癌的治療以手術(shù)為主輔以放化療的綜合治療，但目前治療效果有限，因此研究藥物對于舌鱗癌的治療作用對于舌鱗癌的防治具有重要意義。

塞萊昔布（celecoxib，CELE）是臨床上常用的非甾體抗炎藥物，是環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase Ⅱ，COX-2）的選擇性抑制劑，具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛的作用［4-5］。大量研究表明CELE 對肝癌［6］、胃癌［7］、肺癌［8］、結(jié)腸癌［9］等多種惡性腫瘤具有抑制作用。美國FDA 已批準家族性結(jié)腸腺瘤性息肉病人口服COX-2 抑制劑塞來昔布，用于預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生［10］。目前關(guān)于CELE 抑制舌鱗癌增殖的研究報道較少，因此本實驗探討CELE 對舌鱗癌細胞Cal-27 增殖的抑制作用并探討其作用機制，為CELE 防治舌鱗癌提供臨床前研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人舌鱗癌細胞Cal-27 購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫。CELE（純度＞99%，購自上海阿拉丁試劑有限公司，貨號：C129279）；c-Myc、Cyclin D1、β-actin 上下游引物和探針由北京康為世紀生物科技有限公司設(shè)計并合成；抑癌基因PTEN（9188）兔單克隆抗體、p-AKT（Thr308）（13038）兔單克隆抗體、原癌基因c-Myc（5605）兔單克隆抗體、G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1，2978）兔單克隆抗體、β-actin（4970）兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG 二抗（7074）等購自美國CST 公司。全波長掃描酶標儀（xMark）、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、細胞計數(shù)器（TC20）、實時熒光定量PCR 儀（CFX96）等購自美國伯樂公司；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（G：BOX，SYNGENE 公司，英國）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測CELE對Cal-27細胞的毒性 取對數(shù)生長期細胞，按4 000 個/孔，將Cal-27 細胞接種到96 孔板中，每孔體積為100 μL；設(shè)置空白組（無Cal-27，僅DMEM 培養(yǎng)基）、對照組（0 μmol/L）及不同濃度（10、20、40、60、80、100 μmol/L）的實驗組，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。酶標儀450 nm 波長處測定吸光度（A），計算細胞存活率［（A給藥-A空白）/（A對照-A空白）× 100%］。

1.2.2 實驗分組 取對數(shù)生長期細胞，以1 × 105個/孔接種于培養(yǎng)皿中，根據(jù)CCK-8 細胞毒性實驗結(jié)果，設(shè)對照組（0 μmol/L）及CELE 實驗組（10、20、40 μmol/L），每組設(shè)置3 個復(fù)孔。

1.2.3 Transwell 小室實驗檢測細胞的遷移 采用Transwell 6 孔板試劑盒檢測細胞遷移能力，按照試劑盒的說明書要求，首先配置基質(zhì)膠，與預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)基混合，均勻鋪在Transwell 侵襲上室，37 ℃條件下孵育2 h，然后Transwell 上室每孔計入200 μL/孔不含血清的DMEM 培養(yǎng)液，Transwell 下室加入混有10%胎牛血清的DMEM，每孔500 μL。37 ℃的孵育箱孵育24 h，加入結(jié)晶紫染色試劑，孵育15 min，后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測c-Myc、Cyclin D1 的mRNA 表達水平 將生長狀態(tài)良好的Cal-27 細胞接種于培養(yǎng)皿中進行分組給藥，運用RNA 提取試劑提取Cal-27 細胞RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后運用實時熒光定量PCR 檢測Cal-27 細胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達水平。PCR 擴增條件（反應(yīng)體系為20 μL）：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s，共40 個循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算相關(guān)基因mRNA 的相對表達量。引物序列如下：β-actin（330 dp）：正向：5′-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3′，反向：5′-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3′；c-Myc（133 dp）：正向：5′-TCGGAAGGACTATCCTGCTG-3′，反向：5′-GTGTGTTCGCCTCTTGACATT-3′ ；Cyclin D1（218 dp）：正向：5′-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3′；反向：5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′。

1.2.5 Western blot 檢測增殖相關(guān)蛋白的表達 Cal-27 細胞經(jīng)不同劑量（10、20、40 μmol/L）CELE 給藥作用24 h 后，以及經(jīng)40 μmol/L 的CELE 給藥作用6、12、24 h 后，加入蛋白抽提試劑提取Cal-27 細胞蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白含量。分別取Cal-27 細胞蛋白樣品40 μg，經(jīng)過Tris-HCl 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜（0.45 μm）上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）、磷酸化蛋白 激 酶B（phospho - protein kinase B，p - AKT）（Thr308）、原癌基因蛋白c-Myc、G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）等一抗（1∶1 000）在4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜，TBST 清洗3 次，每次10 min，二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，用TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 顯色后運用G：BOX 成像分析系統(tǒng)獲得條帶，以β-actin 作為內(nèi)參。采用Image J 圖像軟件進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)± 標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CELE 對Cal-27 細胞增殖的抑制作用

運用CCK-8 細胞活力檢測法檢測CELE 對Cal-27 細胞的細胞毒性，結(jié)果如圖1 所示。隨著CELE給藥濃度增大，Cal-27 細胞存活率依次降低，同一濃度給藥時間增長，Cal-27 細胞存活率也隨之降低。當(dāng)CELE 濃度為60 μmol/L 作用24、48 h，Cal-27 細胞存活率分別為68.5%、60.0%，當(dāng)CELE 濃度為40 μmol/L 作用24、48 h，Cal-27 細胞存活率為80.0%、75.0%，表明高劑量（＞40 μmol/L）CELE 對Cal-27 細胞具有明顯的抑制作用，因此選擇10、20、40 μmol/L 對細胞存活率影響較小的劑量作為CELE 的給藥劑量進行下一步的研究。

2.2 不同濃度CELE 對細胞遷移的影響

Transwell 小室實驗檢測結(jié)果顯示，細胞的遷移能力比較：對照組＞10 μmol/L CELE 組＞20 μmol/L CELE 組＞40 μmol/L CELE 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

Figure 1 CCK-8 assay to detect the effect of different concentration of CELE on the survival rate of Cal-27 cells圖1 CCK-8 檢測法檢測不同濃度的CELE 對Cal-27細胞存活率的影響

2.3 不同濃度CELE 對c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表達的影響

結(jié)果如圖3 所示，與對照組比，不同濃度CELE給藥作用后c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達水平均降低，且結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝6.584、7.125，P＜0.05）。表明CELE 能夠抑制c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達從而對Cal-27 細胞增殖具有抑制作用。

2.4 不同濃度CELE 對增殖相關(guān)蛋白表達的影響

不同濃度CELE 給藥作用后檢測PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達情況，與對照組比，不同劑量CELE 給藥組的p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達均下降，PTEN 的表達均上升（F＝6.103，P＜0.05），見圖4。

檢測40 μmol/L 的CELE 給藥作用6、12、24 h后相關(guān)蛋白的表達情況，與對照組比，CELE 給藥后隨著時間的推移，p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達逐漸下降，PTEN 的表達逐漸升高（F＝5.835，P＜0.05），見圖5。表明CELE 能夠激活PTEN 信號通路抑制p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 等增殖相關(guān)蛋白的表達從而抑制Cal-27 細胞增殖。

3 討 論

Figure 2 The effect of different concentrations of CELE on Cal-27 cell invasion（× 200）圖2 不同濃度CELE 對Cal-27 細胞侵襲的影響（× 200）

Figure 3 The effect of CELE on c-Myc, Cyclin D1 mRNA expression in Cal-27 cells圖3 不同濃度CELE 對Cal-27 細胞的c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表達的影響

Figure 4 Effects of different concentrations of CELE on the expression of cell proliferation related proteins PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells圖4 不同濃度CELE 對Cal-27 細胞的細胞增殖相關(guān)蛋白PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 表達的影響

Figure 5 Effects of 40 μmol/L CELE on the expression of PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells at different time圖5 40 μmol/L CELE 作用不同時間對Cal-27 細胞的細胞增殖相關(guān)蛋白PTEN、p-AKT（Thr308）、c-Myc、Cyclin D1 表達的影響

CELE 作為一種臨床上用于抗炎鎮(zhèn)痛的藥物，研究表明其能夠激活PTEN 信號通路抑制AKT 信號通路，對多種腫瘤具有抑制作用。本實驗考察了不同濃度的CELE 對舌鱗癌細胞Cal-27 的抑制作用。研究結(jié)果表明，不同濃度的CELE 對舌鱗癌細胞Cal-27 均具有一定的增殖抑制作用，同時不同劑量CELE 作用24 h 及相同劑量CELE 作用不同時間均能夠激活PTEN 從而抑制AKT 活化抑制c-Myc、Cyclin D1 的表達從而抑制舌鱗癌細胞Cal-27增殖。

PTEN 是機體內(nèi)的抑癌基因，對腫瘤細胞增殖具有負調(diào)節(jié)作用［12］。研究表明在舌鱗癌中PTEN失活，具有促進舌鱗癌細胞增殖及抗凋亡的作用［13］。PTEN 失活能夠使其下游AKT 磷酸化水平增加其中主要是p-AKT（Thr308）磷酸化水平增加從而激活A(yù)KT 信號通路，AKT 信號通路能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞能量代謝、增殖、抗凋亡等相關(guān)信號通路促進腫瘤細胞增殖［14］。Li 等［15］研究表明過表達AKT 能夠誘導(dǎo)形成肝癌，同時等研究表明沉默PTEN 基因的表達能夠激活A(yù)KT 信號通路從而促進腫瘤的形成、發(fā)生和發(fā)展。c-Myc、Cyclin D1 是AKT 信號通路下游重要的增殖相關(guān)基因，c-Myc 能夠參與介導(dǎo)細胞外的傳入生物信號向細胞核內(nèi)傳遞，調(diào)控細胞增殖和凋亡［16-18］。Liu 等［19］研究表明c-Myc 過表達能夠誘導(dǎo)肝細胞惡性轉(zhuǎn)化從而形成腫瘤。Cyclin D1 是影響腫瘤細胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子［20］。PTEN 失活能夠激活A(yù)KT 信號通路從而調(diào)控c-Myc、Cyclin D1 的表達，對腫瘤細胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化具有重要作用。

綜上所述，CELE 作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗炎鎮(zhèn)痛藥物對舌鱗癌細胞Cal-27 增殖具有抑制作用，表明CELE 對于防治舌鱗癌具有一定的應(yīng)用研究價值。