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        塞萊昔布對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 增殖的抑制作用

        2020-06-11 05:58:10曹順順汪曉龍舒?zhèn)骼^邵劍杰
        口腔疾病防治 2020年7期
        關(guān)鍵詞:鱗癌癌細(xì)胞存活率

        曹順順, 汪曉龍, 舒?zhèn)骼^, 邵劍杰

        鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科,湖北 黃石(435002)

        舌鱗癌是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一,與口咽癌位列全身惡性腫瘤的第6 位[1-2]。舌鱗癌的發(fā)病原因尚未明確,但是研究表明,吸煙、嗜酒等因素與舌鱗癌的發(fā)生有關(guān)[3]。目前臨床上對(duì)于舌鱗癌的治療以手術(shù)為主輔以放化療的綜合治療,但目前治療效果有限,因此研究藥物對(duì)于舌鱗癌的治療作用對(duì)于舌鱗癌的防治具有重要意義。

        塞萊昔布(celecoxib,CELE)是臨床上常用的非甾體抗炎藥物,是環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase Ⅱ,COX-2)的選擇性抑制劑,具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛的作用[4-5]。大量研究表明CELE 對(duì)肝癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、結(jié)腸癌[9]等多種惡性腫瘤具有抑制作用。美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)家族性結(jié)腸腺瘤性息肉病人口服COX-2 抑制劑塞來昔布,用于預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生[10]。目前關(guān)于CELE 抑制舌鱗癌增殖的研究報(bào)道較少,因此本實(shí)驗(yàn)探討CELE 對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 增殖的抑制作用并探討其作用機(jī)制,為CELE 防治舌鱗癌提供臨床前研究依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        人舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)。CELE(純度>99%,購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司,貨號(hào):C129279);c-Myc、Cyclin D1、β-actin 上下游引物和探針由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成;抑癌基因PTEN(9188)兔單克隆抗體、p-AKT(Thr308)(13038)兔單克隆抗體、原癌基因c-Myc(5605)兔單克隆抗體、G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1,2978)兔單克隆抗體、β-actin(4970)兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG 二抗(7074)等購(gòu)自美國(guó)CST 公司。全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀(xMark)、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)器(TC20)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(CFX96)等購(gòu)自美國(guó)伯樂公司;化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(G:BOX,SYNGENE 公司,英國(guó))。

        1.2 方法

        1.2.1 CCK-8法檢測(cè)CELE對(duì)Cal-27細(xì)胞的毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按4 000 個(gè)/孔,將Cal-27 細(xì)胞接種到96 孔板中,每孔體積為100 μL;設(shè)置空白組(無Cal-27,僅DMEM 培養(yǎng)基)、對(duì)照組(0 μmol/L)及不同濃度(10、20、40、60、80、100 μmol/L)的實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率[(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)× 100%]。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以1 × 105個(gè)/孔接種于培養(yǎng)皿中,根據(jù)CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)對(duì)照組(0 μmol/L)及CELE 實(shí)驗(yàn)組(10、20、40 μmol/L),每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

        1.2.3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移 采用Transwell 6 孔板試劑盒檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,按照試劑盒的說明書要求,首先配置基質(zhì)膠,與預(yù)冷的DMEM 培養(yǎng)基混合,均勻鋪在Transwell 侵襲上室,37 ℃條件下孵育2 h,然后Transwell 上室每孔計(jì)入200 μL/孔不含血清的DMEM 培養(yǎng)液,Transwell 下室加入混有10%胎牛血清的DMEM,每孔500 μL。37 ℃的孵育箱孵育24 h,加入結(jié)晶紫染色試劑,孵育15 min,后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)c-Myc、Cyclin D1 的mRNA 表達(dá)水平 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Cal-27 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行分組給藥,運(yùn)用RNA 提取試劑提取Cal-27 細(xì)胞RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Cal-27 細(xì)胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達(dá)水平。PCR 擴(kuò)增條件(反應(yīng)體系為20 μL):95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s,共40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參,采用2-△△Ct方法計(jì)算相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:β-actin(330 dp):正向:5′-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3′,反向:5′-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3′;c-Myc(133 dp):正向:5′-TCGGAAGGACTATCCTGCTG-3′,反向:5′-GTGTGTTCGCCTCTTGACATT-3′ ;Cyclin D1(218 dp):正向:5′-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3′;反向:5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′。

        1.2.5 Western blot 檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) Cal-27 細(xì)胞經(jīng)不同劑量(10、20、40 μmol/L)CELE 給藥作用24 h 后,以及經(jīng)40 μmol/L 的CELE 給藥作用6、12、24 h 后,加入蛋白抽提試劑提取Cal-27 細(xì)胞蛋白,BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量。分別取Cal-27 細(xì)胞蛋白樣品40 μg,經(jīng)過Tris-HCl 凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)至PVDF 膜(0.45 μm)上,5%脫脂牛奶封閉1 h后,蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)、磷酸化蛋白 激 酶B(phospho - protein kinase B,p - AKT)(Thr308)、原癌基因蛋白c-Myc、G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)等一抗(1∶1 000)在4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜,TBST 清洗3 次,每次10 min,二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,用TBST 清洗3 次,每次10 min,ECL 顯色后運(yùn)用G:BOX 成像分析系統(tǒng)獲得條帶,以β-actin 作為內(nèi)參。采用Image J 圖像軟件進(jìn)行灰度值分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞增殖的抑制作用

        運(yùn)用CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)法檢測(cè)CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞的細(xì)胞毒性,結(jié)果如圖1 所示。隨著CELE給藥濃度增大,Cal-27 細(xì)胞存活率依次降低,同一濃度給藥時(shí)間增長(zhǎng),Cal-27 細(xì)胞存活率也隨之降低。當(dāng)CELE 濃度為60 μmol/L 作用24、48 h,Cal-27 細(xì)胞存活率分別為68.5%、60.0%,當(dāng)CELE 濃度為40 μmol/L 作用24、48 h,Cal-27 細(xì)胞存活率為80.0%、75.0%,表明高劑量(>40 μmol/L)CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞具有明顯的抑制作用,因此選擇10、20、40 μmol/L 對(duì)細(xì)胞存活率影響較小的劑量作為CELE 的給藥劑量進(jìn)行下一步的研究。

        2.2 不同濃度CELE 對(duì)細(xì)胞遷移的影響

        Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞的遷移能力比較:對(duì)照組>10 μmol/L CELE 組>20 μmol/L CELE 組>40 μmol/L CELE 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

        Figure 1 CCK-8 assay to detect the effect of different concentration of CELE on the survival rate of Cal-27 cells圖1 CCK-8 檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度的CELE 對(duì)Cal-27細(xì)胞存活率的影響

        2.3 不同濃度CELE 對(duì)c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)的影響

        結(jié)果如圖3 所示,與對(duì)照組比,不同濃度CELE給藥作用后c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達(dá)水平均降低,且結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.584、7.125,P<0.05)。表明CELE 能夠抑制c-Myc、Cyclin D1 mRNA 的表達(dá)從而對(duì)Cal-27 細(xì)胞增殖具有抑制作用。

        2.4 不同濃度CELE 對(duì)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        不同濃度CELE 給藥作用后檢測(cè)PTEN、p-AKT(Thr308)、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達(dá)情況,與對(duì)照組比,不同劑量CELE 給藥組的p-AKT(Thr308)、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達(dá)均下降,PTEN 的表達(dá)均上升(F=6.103,P<0.05),見圖4。

        檢測(cè)40 μmol/L 的CELE 給藥作用6、12、24 h后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,與對(duì)照組比,CELE 給藥后隨著時(shí)間的推移,p-AKT(Thr308)、c-Myc、Cyclin D1 等蛋白的表達(dá)逐漸下降,PTEN 的表達(dá)逐漸升高(F=5.835,P<0.05),見圖5。表明CELE 能夠激活PTEN 信號(hào)通路抑制p-AKT(Thr308)、c-Myc、Cyclin D1 等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制Cal-27 細(xì)胞增殖。

        3 討 論

        Figure 2 The effect of different concentrations of CELE on Cal-27 cell invasion(× 200)圖2 不同濃度CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞侵襲的影響(× 200)

        Figure 3 The effect of CELE on c-Myc, Cyclin D1 mRNA expression in Cal-27 cells圖3 不同濃度CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞的c-Myc、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)的影響

        Figure 4 Effects of different concentrations of CELE on the expression of cell proliferation related proteins PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells圖4 不同濃度CELE 對(duì)Cal-27 細(xì)胞的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PTEN、p-AKT(Thr308)、c-Myc、Cyclin D1 表達(dá)的影響

        Figure 5 Effects of 40 μmol/L CELE on the expression of PTEN, p-Akt (Thr308), c-Myc and cyclin D1 in Cal-27 cells at different time圖5 40 μmol/L CELE 作用不同時(shí)間對(duì)Cal-27 細(xì)胞的細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PTEN、p-AKT(Thr308)、c-Myc、Cyclin D1 表達(dá)的影響

        CELE 作為一種臨床上用于抗炎鎮(zhèn)痛的藥物,研究表明其能夠激活PTEN 信號(hào)通路抑制AKT 信號(hào)通路,對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的CELE 對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 的抑制作用。研究結(jié)果表明,不同濃度的CELE 對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 均具有一定的增殖抑制作用,同時(shí)不同劑量CELE 作用24 h 及相同劑量CELE 作用不同時(shí)間均能夠激活PTEN 從而抑制AKT 活化抑制c-Myc、Cyclin D1 的表達(dá)從而抑制舌鱗癌細(xì)胞Cal-27增殖。

        PTEN 是機(jī)體內(nèi)的抑癌基因,對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有負(fù)調(diào)節(jié)作用[12]。研究表明在舌鱗癌中PTEN失活,具有促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增殖及抗凋亡的作用[13]。PTEN 失活能夠使其下游AKT 磷酸化水平增加其中主要是p-AKT(Thr308)磷酸化水平增加從而激活A(yù)KT 信號(hào)通路,AKT 信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞能量代謝、增殖、抗凋亡等相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14]。Li 等[15]研究表明過表達(dá)AKT 能夠誘導(dǎo)形成肝癌,同時(shí)等研究表明沉默PTEN 基因的表達(dá)能夠激活A(yù)KT 信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤的形成、發(fā)生和發(fā)展。c-Myc、Cyclin D1 是AKT 信號(hào)通路下游重要的增殖相關(guān)基因,c-Myc 能夠參與介導(dǎo)細(xì)胞外的傳入生物信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞,調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[16-18]。Liu 等[19]研究表明c-Myc 過表達(dá)能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化從而形成腫瘤。Cyclin D1 是影響腫瘤細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子[20]。PTEN 失活能夠激活A(yù)KT 信號(hào)通路從而調(diào)控c-Myc、Cyclin D1 的表達(dá),對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化具有重要作用。

        綜上所述,CELE 作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗炎鎮(zhèn)痛藥物對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Cal-27 增殖具有抑制作用,表明CELE 對(duì)于防治舌鱗癌具有一定的應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。

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