何洪標(biāo)，梁俏敏，鄭曙光

廣東省中山市陳星海醫(yī)院(中山 5281415)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是一種高發(fā)病率、高病死率的惡性腫瘤。據(jù)調(diào)查研究報(bào)告，我國患結(jié)直腸癌病的人數(shù)以及此疾病死亡人數(shù)逐年增加，這與人們的飲食習(xí)慣密切相關(guān)，目前大家比較熱衷于追求刺激味蕾的重口味食物。結(jié)直腸癌的治療手段有化療、放療以及手術(shù)等[1]。結(jié)直腸癌高發(fā)于老年群體，但是由于老年患者一系列身體機(jī)能的衰退，對(duì)治療的要求更高，目前現(xiàn)有的治療手段難以滿足老年人治療的要求。因此研究出一種更好的治療手段迫在眉睫[2]，故本研究提出結(jié)直腸鋸齒狀息肉病相關(guān)通道蛋白表達(dá)水平對(duì)患者病情的影響，為臨床研究提供依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 2015年3月至2019年8月，對(duì)中山市陳星海醫(yī)院消化內(nèi)科85例結(jié)直腸鋸齒狀息肉病患者及健康體檢中心85例健康居民進(jìn)行了臨床調(diào)查研究。入組患者均簽署研究同意書。本研究獲得中山市陳星海醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。直腸鋸齒狀息肉病診斷參照WHO公布的鋸齒狀息肉綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)：近端結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)至少有5個(gè)鋸齒狀病變，并且其中至少2個(gè)鋸齒狀息肉直徑超過10 mm；有SPS家族史并發(fā)現(xiàn)存在1個(gè)及以上的結(jié)直腸鋸齒狀息肉；整個(gè)結(jié)直腸腸腔中發(fā)現(xiàn)超過20個(gè)以上的鋸齒狀息肉。符合上述三個(gè)指標(biāo)任意一個(gè)即可診斷。共同納入標(biāo)準(zhǔn)：無重要臟器功能障礙；無腫瘤史；無消化系統(tǒng)手術(shù)史；臨床資料完整；Karonfsky評(píng)分超過60分。共同排除標(biāo)準(zhǔn)：哺乳期婦女、孕婦或其他特殊情況者；近30 d有接受消化系統(tǒng)系統(tǒng)性治療的患者；糖尿病、高血脂癥、高血壓等慢性疾病者。健康組85例，男51例，女34例；年齡34～55歲，平均(50.12±4.02)歲；BMI(22.81±0.64)kg/m2。疾病組85例，男53例，女32例；年齡34～55歲，平均(52.05±3.02)歲；BMI(22.79±0.21)kg/m2；病程10～21個(gè)月，平均(14.25±3.28)個(gè)月。兩組患者均衡性好，可比性高。

2 檢測(cè)方法 對(duì)兩組相關(guān)通道蛋白采用免疫組化方法進(jìn)行定性檢測(cè)，具體包括P-gP(P-糖蛋白，P - glycoprotein)；Survivin(凋亡抑制蛋白，Apoptotic inhibitor protein)；HSP70(重組人HSP70蛋白，Recombinant human HSP70 protein)；EHD2(EHD2人源全長重組蛋白，EHD2 human full-length recombinant protein)。在內(nèi)鏡輔助下取病理標(biāo)本，將切片脫蠟至水，滴加3%過氧化氫液室溫下避光孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。而后將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)中，入微波爐中修復(fù)8 min，PBS沖洗3 min×3次，濾紙吸干PBS液。滴加正常山羊血清，室溫下孵育15 min，中和非特異性反應(yīng)。滴加BRAF(1∶100濃度)、EphB2兔抗人特異性抗體(1∶150濃度)，入濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜。次日滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育20 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫下孵育15 min。DAB底物顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蘇木精復(fù)染，鹽酸(濃度1.0%)酒精分化5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。陽性染色均為棕黃色(或棕褐色顆粒)，多集中于細(xì)胞質(zhì)中，少量在細(xì)胞膜。

3 結(jié)果判定 按染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)。按陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：<5.0%(0分)、5.0%～25.0%(1分)、26.0%～50.0%(2分)、51.0%～75.0%(3分)、>75%)4分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為每張切片組織染色結(jié)果，最終根據(jù)乘積結(jié)果進(jìn)行定性判定，>3分記為陽性，≤3分則為陰性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組相關(guān)通道蛋白檢出情況比較 兩組對(duì)象四種通道蛋白(P-gP、Survivin、HSP70、EHD2)檢出情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，疾病組患者通道蛋白檢出率均高于對(duì)照組。見表1。

表1 兩組對(duì)象相關(guān)通道蛋白檢出情況比較(例)

2 不同情況或病情疾病組患者相關(guān)通道蛋白檢出情況比較 P-gP檢出情況比較，性別、年齡、息肉直徑、分化程度、浸潤深度、臨床分期對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Survivin檢出情況比較，年齡、息肉直徑、浸潤深度、臨床分期對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HSP70檢出情況比較，性別、分化程度對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EHD2檢出情況比較，年齡對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

討 論

結(jié)直腸鋸齒狀息肉包括傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤、增生性息肉以及SSP/P，其特點(diǎn)為惡性潛能的組織學(xué)發(fā)生病變。SSP/P是散發(fā)性結(jié)直腸癌癌前病變的重要標(biāo)志。結(jié)直腸鋸齒狀息肉病變的病理學(xué)特點(diǎn)以及內(nèi)鏡的表現(xiàn)因病變類型而異，組織學(xué)特征是確診此疾病的重要手段[3]。鋸齒狀息肉病綜合征患者患結(jié)直腸癌的概率極高，患者通常具有數(shù)個(gè)鋸齒狀息肉。結(jié)直腸癌在臨床上較為常見，在我國經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展的形勢(shì)下，人們的經(jīng)濟(jì)水平日益提高，生活質(zhì)量也發(fā)生了質(zhì)的飛躍，導(dǎo)致人們的生活方式發(fā)生了轉(zhuǎn)變，人們更傾向于追求味蕾的刺激，而結(jié)直腸癌作為消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢(shì)[4]。

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)疾病組患者四種通道蛋白(P-gP、Survivin、HSP70、EHD2)檢出率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P-gP檢出情況比較，性別、年齡、息肉直徑、分化程度、浸潤深度、臨床分期對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Survivin檢出情況比較，年齡、息肉直徑、浸潤深度、臨床分期對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSP70檢出情況比較，性別、分化程度對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EHD2檢出情況比較，年齡對(duì)其影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析患者不同臨床特征對(duì)各通道蛋白表達(dá)含量的影響，性別因素可能與結(jié)直腸鋸齒狀息肉流行特征有關(guān)，該病在男女人群中的發(fā)病率本身存在一定固有差異，這種流行趨勢(shì)可能一定程度影響了多項(xiàng)通道蛋白的檢出含量。同時(shí)，由于本研究篩選的通道蛋白為疾病特征性蛋白，息肉直徑較大、分化程度和浸潤深度相對(duì)較高、臨床分期級(jí)別較高的臨床患者，其通道蛋白表達(dá)含量相對(duì)較高。也可能與病情較重的患者，其內(nèi)環(huán)境紊亂更為嚴(yán)重，原發(fā)病灶持續(xù)存在進(jìn)而影響了通道蛋白的表達(dá)有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步深入分析。

表2 不同情況或病情疾病組患者相關(guān)通道蛋白檢出情況比較(例)

Survivin是一種很好的治療候選基因，它可以作為診斷腫瘤的標(biāo)志物。它在細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)揮重要的作用，同時(shí)它也參與腫瘤細(xì)胞生長、凋亡和放療抵抗等多種功能調(diào)節(jié)[5]。Survivin蛋白與結(jié)直腸癌的演進(jìn)和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的關(guān)系，在腫瘤組織中Survivin蛋白會(huì)處于極高表達(dá)的狀態(tài)，它對(duì)血管的生成起促進(jìn)作用，臨床上將Survivin蛋白又稱為腫瘤細(xì)胞的存活素，因?yàn)檫@種蛋白具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、耐藥性以及增殖等能力。Survivin蛋白可以通過作用于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3以及Caspase-9從而對(duì)腫瘤的惡化進(jìn)程起促進(jìn)作用。同時(shí)它能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的凋亡起到抑制作用[6-8]。 Survivin蛋白除與抑制凋亡和保護(hù)細(xì)胞存活外，還參與腫瘤血管形成，對(duì)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等有關(guān)[9]。Survivin蛋白能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量增殖和瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Survivin通道蛋白的表達(dá)能夠隨著結(jié)直腸癌患者血清中腫瘤標(biāo)志物CEA的含量增多而增加。因此造成疾病組患者Survivin通道蛋白檢出率均高于對(duì)照組。P-gP是一種能量依賴性的跨膜蛋白，它是由MDR-1基因編碼的。P-gp蛋白陽性率的高低受淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期進(jìn)程的影響，如果檢出P-gP蛋白陽性率出現(xiàn)升高趨勢(shì)就提示P-gp蛋白高水平的表達(dá)。P-gp蛋白與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性有一定的關(guān)系，在能量充足的前提下，它能夠依靠“藥泵”的功能將各種化合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，例如與化療有關(guān)的藥物[10-14]。P-gP可以參與信號(hào)通路,比如它可以阻斷一些信號(hào)通路，如P13K/AKT信號(hào)通路，從而可以使細(xì)胞的藥物敏感性得到增強(qiáng)。在臨床上P-gP通常作為判斷腫瘤耐藥性以及此疾病化療效果的標(biāo)志物。

HSP70是一種協(xié)同免疫的蛋白質(zhì)。HSP70在正常情況下呈現(xiàn)低水平表達(dá)。當(dāng)機(jī)體受到高溫刺激以及處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)會(huì)導(dǎo)致HSP70的合成迅速增加以提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力。HSP70與細(xì)胞的多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，如細(xì)胞的生長、分化等。據(jù)資料顯示HSP70可能與患者出現(xiàn)熱耐受有關(guān)，從而會(huì)導(dǎo)致抗癌效果差[15-17]。熱休克應(yīng)答可使細(xì)胞產(chǎn)生HSP70，為熱應(yīng)激后產(chǎn)生的一系列保護(hù)性應(yīng)激蛋白的一部分，對(duì)細(xì)胞的生存起重要作用[18]。EHD2是一種存在于膜內(nèi)的內(nèi)吞調(diào)控蛋白，它具有調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抑制惡性腫瘤的功能，據(jù)資料表明EHD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)。結(jié)直腸癌的分化程度以及淋巴轉(zhuǎn)移都會(huì)對(duì)EHD2的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響，在結(jié)直腸癌處于較低的分化程度時(shí)，EHD2這種蛋白的表達(dá)也較低[19-20]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)P-gP、Survivin、HSP70、EHD2這四種通道蛋白都與結(jié)直腸癌的分化程度以及淋巴轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)系，四者存在協(xié)同的作用，至于其中具體的機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)P-gP、Survivin、HSP70、EHD2這四種通道蛋白與結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)變以及發(fā)展等具有較為密切的關(guān)系，對(duì)P-gP、Survivin、HSP70、EHD2這四種通道蛋白的檢測(cè)有利于對(duì)疾病的診斷以及病情的評(píng)估，故結(jié)直腸鋸齒狀息肉病相關(guān)通道蛋白表達(dá)水平對(duì)患者病情評(píng)估價(jià)值可在臨床實(shí)踐中應(yīng)用。