甄輝， 趙博生

(山東理工大學發(fā)育與進化生物學研究所，山東淄博255000)

哺乳動物中，磷脂酶C(PLC)根據(jù)序列同源性和結構域的位置，可分為β、γ和δ三大類(Rhee，2001；Fukami，2002；Hwangetal.，2005；Nakaharaetal.，2005；Zhouetal.，2005)，是一種存在于細胞膜上的關鍵酶。在大腦中，PLC-β家族的表達譜比較清楚，PLC-β1、β3和β4是最常見的酶型且有其獨特的表達模式。PLC-β1在大腦皮層和海馬中高表達，在小腦中表達較少(Rossetal.，1989)；PLC-β4在小腦中表達最高，在大腦皮層和海馬中的表達量極低，而PLC-β3在整個腦中的表達量都很低(Tanaka & Kondo，1994)。

PLCβ4基因的異常表達與癲癇、精神分裂癥、亨廷頓病、抑郁癥等腦部疾病相關(Yangetal.，2016)。研究結果表明，PLCβ4基因缺陷小鼠Musmusculus的視覺系統(tǒng)會出現(xiàn)功能障礙，PLCβ4在視桿外部的初始光層疊后的視覺處理中起到重要作用(Jiangetal.，1996)。PLCβ4基因突變小鼠表現(xiàn)出運動障礙和運動性共濟失調的癥狀，尤其是后肢更嚴重(Kimetal.，1997)。PLCβ4還與生物鐘功能相關，研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的肝臟中，PLCβ4基因和蛋白的表達受晝夜節(jié)律的調控，而不依賴于外部光周期(Kleinetal.，2008)。PLCβ4在睡眠-覺醒和體溫節(jié)律中也發(fā)揮著重要的作用。

神經系統(tǒng)是后生動物中最復雜的器官系統(tǒng)之一。神經網絡調節(jié)動物生理學和控制行為等方面。因此，了解神經系統(tǒng)如何在整個生命中發(fā)育、功能和重塑是一個有趣且具有挑戰(zhàn)性的研究熱點。與線蟲或果蠅相比，渦蟲因其強大再生能力而備受關注(Baguna，2012；Rink，2013)。此外，渦蟲是擁有前腦部化(“大腦”)的最原始生物，這很可能代表人類大腦的祖先(Sarnat & Netsky，1985，2002)。東亞三角渦蟲Dugesiajaponica屬扁形動物門Platyhelminthes渦蟲綱Turbellaria三腸目Tricladida(劉德增，1989)，有2種繁殖方式：有性生殖和無性生殖。無性生殖是指渦蟲本體受到外界或自身條件影響而斷裂，并再生出完整個體。有性生殖會產生具有多個受精卵和外卵黃細胞組成的卵囊，胚胎在卵囊內發(fā)育，發(fā)育過程分為8個階段(Yuanetal.，2010，2014；甄輝等，2016)。每個卵囊里含有1～10個處于不同發(fā)育階段的受精卵，受精卵的周圍充滿了大量的外卵黃，其在卵囊中發(fā)育直至幼蟲(Hartenstein & Ehlers，2000)。

為了研究PLCβ4在渦蟲胚胎發(fā)育中的表達譜，本文通過RT-PCR和RACE技術克隆得到東亞三角渦蟲PLCβ4基因，并利用整體原位雜交技術研究了其在渦蟲胚胎發(fā)育中的時空表達圖譜。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

東亞三角渦蟲胚胎采自山東省淄博市博山泉河頭；成體為實驗室培養(yǎng)單系，飼養(yǎng)在魯山山泉水中。胚胎經DEPC水沖洗后，用解剖針扎破，4%多聚甲醛室溫固定30 min，30%、50%、75%甲醇梯度脫水，100%甲醇-20 ℃保存待用。實驗前成體饑餓1周。胚胎每組實驗樣本量為8個，成體實驗樣本量為10條。PMD18-T載體為TaKaRa，EscherichiacoliDH5α為實驗室保存。

1.2 引物設計與PCR擴增

引物設計PLCβ4(F和R)(表1)和PCR步驟參照甄輝等(2016)。利用TRIZOL試劑提取渦蟲總RNA，測量RNA濃度，利用Fermentas反轉錄試劑盒合成cDNA模板。由上海Sangon公司合成。以渦蟲cDNA為模版，利用F和R引物進行PCR擴增，反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，利用OMEGA膠回收試劑盒回收。將純化回收的PCR產物連接到PMD18-T載體上送上海博尚生物技術有限公司測序。

1.3 通過RACE技術獲得PLCβ4全長

根據(jù)測序獲得的部分PLCβ4序列設計RACE 5’和3’的引物(表1)。RACE-PCR反應程序參照甄輝等(2016)。5’-和3’-cDNA模板利用Clontech BD SMARTAM RACE cDNA Amplification Kit反轉錄試劑盒反轉錄。RACE-PCR的循環(huán)程序如下：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR擴增產物通過膠回收純化，并連接到PMD18-T載體上送上海博尚生物技術有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

生物信息學分析的軟件和步驟參照甄輝等(2016)。序列用DNAtools進行蛋白質序列翻譯，在NCBI中BLASTP(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)，尋找存在的同源基因。用DNASTAR中的MegAlign分析同源蛋白質序列之間的相似性，利用MEGA 7的最大似然法對其進行進化樹分析，重復1 000次。

1.5 DIG-Labeling RNA探針合成

根據(jù)測序獲得的基因序列設計引物(表1)。首先，利用PCR獲得3’端有T7啟動子的PCR產物，沉降純化回收后連接到PMD18-T載體上送上海博尚生物技術有限公司測序。DIG-Labeling RNA探針合成體系：模板(3’端帶有T7啟動子的PCR產物1 mg)，T7 RNA polymerase(Promega，Madison，美國)，DTT(Promega，Madison，美國)，DIG-Labeling RNA Mix(Roche)和RNAse Inhibitor(Fermentas，Waltham，美國)，37 ℃孵育12 h。

表1 實驗引物設計Table 1 Primers used in this study

1.6 原位雜交

原位雜交參照甄輝等(2016)和Zhen等(2019)的方法。胚胎固定時經DEPC水沖洗后，用5 mm解剖針扎破，幼蟲經5%NAC處理5 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，30%、50%、75%甲醇梯度脫水，100%甲醇-20 ℃保存待用或直接用于原位雜交。原位雜交時甲醇(75%、50%、30%)梯度復水；10 μg·mL-1Proteinase K室溫下消化10 min；4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.1 mol·L-1三乙醇胺加0.25%乙酸酐進行乙?；?；56 ℃預雜交2 h；雜交時加入1 μg·mL-1RNA探針，56 ℃雜交16 h。雜交后洗滌，10%馬血清溶液封閉2 h；anti-Dig antibody (1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；室溫條件下，馬來酸緩沖液清洗8次，AP Buffer孵育10 min；加入5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate和nitroblue tetrazolium(BCIP/NBT；Roche)顯色液后，放置暗處顯色；在合適信噪比時終止反應，用Nikon AZ100體視顯微鏡進行拍照。

2 結果

2.1 基因克隆

利用RT-PCR引物擴增的PCR產物大小為1 084 bp；利用5’-RACE引物GSP-1、GSP-2擴增的PCR產物大小分別為1 246 bp和963 bp，利用3’-RACE引物GSP3擴增的PCR產物大小為418 bp(圖1：A)。將測序獲得序列比對拼接，結果顯示，從東亞三角渦蟲中克隆得到的DjPLCβ4基因全長為3 245 bp，最大開放閱讀框為2 907 bp，編碼969個氨基酸組成的蛋白質，該蛋白質的預測分子量約為110.55 kDa，5’非翻譯區(qū)為42 bp，3’非翻譯區(qū)為296 bp，5’端有1個起始密碼子，3’非翻譯區(qū)包含多聚腺苷酸化信號位點和poly(A)尾，由此認為，克隆得到的cDNA為全長序列，GenBank登錄號詳見表2。

圖1 DjPLCβ4基因獲得的引物位置(A)和結構域(B)Fig. 1 Schematic representation of the amplified gene region (A) and structure (B) of DjPLCβ4 gene

表2 本研究所用物種PLCβ4基因序列的GenBank登錄號Table 2 GenBank accession numbers of PLCβ4 genes used in this study

2.2 生物信息學分析

在NCBI BLASTP(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析獲得的氨基酸序列，該氨基酸包含PH結構域、EF-hand結構域、X+Y結構域、C2結構域和DUF結構域(圖1：B)。相似性結果顯示，與其他物種PLCβ4蛋白相似性在36%以上，與選取的脊椎動物PLCβ4蛋白相似性為55%。選擇6種代表性物種，將不同物種的PLCβ4蛋白的不同結構域用MegAlign比對，結果表明，DjPLCβ4是一個非常保守的蛋白質，與其他物種的PH結構域、EF-hand結構域、X+Y結構域、C2結構域的相似性很高。為了進一步驗證DjPLCβ4的進化地位，選擇了7種代表性物種的PLC[β(1～4)、γ(1，2)、δ(1，3，4)、η(1，2)、ζ1、ε1]蛋白氨基酸序列，MEGA 7構建的進化樹顯示，DjPLCβ4與其他物種PLCβ4聚為一支，并位于兩側對稱動物的基部(紅色方框)，符合進化地位，進一步驗證了DjPLCβ4是PLCβ4的一員(圖2)。因此，將其命名為DjPLCβ4。

圖2 MAGE 7(最大似然法)構建DjPLCβ4的系統(tǒng)進化樹(bootstrap=1 000)
Fig. 2 Phylogenic tree of DjPLCβ4 constructed by MAGE 7 (Maximum likelihood tree)(bootstrap=1 000)

2.3 原位雜交

為探索DjPLCβ4基因在渦蟲胚胎發(fā)育中的表達圖譜，利用原位雜交技術檢測DjPLCβ4基因在不同胚胎時期的表達圖譜。結果顯示，第1、2階段(胚胎卵裂期)沒有檢測到DjPLCβ4基因的陽性信號(圖3：B)；第3階段，胚胎開始分化，形成胚胎咽，外卵黃被胚胎咽吸收，隨著外卵黃不斷變大，合胞體被擠到最外層，并形成含有胚胎細胞的胚帶，DjPLCβ4基因主要表達于胚胎咽和胚帶(圖3：C)。第4階段，外卵黃繼續(xù)被胚胎咽吸入，胚胎體積達到最大并開始變形，DjPLCβ4基因主要表達于神經原基、胚胎咽及胚帶(圖3：D)；第5階段，合胞體出現(xiàn)解體，胚胎逐漸變?yōu)楸鈭A形，細胞和組織開始分化形成表皮細胞和肌肉細胞，DjPLCβ4基因主要表達于咽原基和神經原基(圖3：E)；第6階段，胚胎不斷變大，大量細胞出現(xiàn)分化，腹神經更加明顯，且第一個器官咽形成，DjPLCβ4基因主要表達于咽和神經系統(tǒng)，且頭部信號較明顯(圖3：F)；第7、8階段，胚胎大腦形成，神經系統(tǒng)進一步成熟，胚胎邊緣逐漸形成原始的神經系統(tǒng)，DjPLCβ4基因主要表達于神經系統(tǒng)(圖3：G)。

圖3 DjPLCβ4基因在東亞三角渦蟲胚胎發(fā)育中的表達Fig. 3 Expression of DjPLCβ4 gene by whole-mount in situ hybridization during embryonic development of Dugesia japonica

A. 對照組， B. 第1和2階段， C. 第3階段， D. 第4階段， E. 第5階段， F. 第6階段， G. 第7和8階段； 比例尺=100 μm

A. control， B. stages 1 and 2， C. stage 3， D. stage 4， E. stage 5， F. stage 6， G. stages 7 and 8； scale bars=100 μm

隨后，胚胎發(fā)育成熟，孵化出幼蟲，1周后長成成體。利用整體原位雜交技術檢測到DjPLCβ4基因主要表達于成體的腦和咽(圖4：B)。

圖4 DjPLCβ4基因在東亞三角渦蟲整體中的表達圖式Fig. 4 Expression analysis of DjPLCβ4 gene in the intact planarian

A. 對照組， B.DjPLCβ4基因表達于腦和咽(箭頭)； 比例尺=500 μm

A. control， B.DjPLCβ4gene expressed in the brain and pharynx (arrows)； scale bars=500 μm

3 討論

磷脂酰肌醇代謝是一個重要的細胞內信號系統(tǒng)，參與多種細胞功能，包括激素分泌、神經遞質傳遞、生長因子信號、細胞膜運輸和細胞骨架調節(jié)等(Janetopoulos & Devreotes，2006；Santariusetal.，2006；Cockcroft & Carvou，2007)。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C是該系統(tǒng)中的關鍵酶，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸[PI(4，5)P2]生成肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)2個第二信使，以響應激素、神經遞質、生長因子激活受體和其他分子(Nakamura & Fukami，2009)。從哺乳動物中克隆出13種PLC同工酶，根據(jù)結構和調控激活機制可分為以下6類：PLC-δ(1，3，4)、PLC-β(1～4)、PLC-γ(1，2)、PLC-ε、PLC-ζ、PLC-η(1，2)(Rhee，2001；Fukami，2002；Hwangetal.，2005；Nakaharaetal.，2005；Zhouetal.，2005)。每一種同工酶都由亞型特異的保守結構域組成。所有的PLC同工酶都含有催化的X+Y結構域以及各種調控結構域，包括C2結構域、EF-hand結構域和PH結構域。在東亞三角渦蟲中獲得DjPLCβ4基因，利用NCBI BLASTP (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對編碼的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該氨基酸包含PH結構域、EF-hand結構域、X+Y結構域和C2結構域，這與上述文獻結果相同。進化分析結果顯示，DjPLCβ4與選取物種的PLCβ4聚為一支，并位于兩側對稱動物的基部，符合進化地位，進一步證明DjPLCβ4是PLCβ4的一員。

PLCs在器官形成和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，PLCβ1、β3、γ1和γ2在小鼠卵細胞中表達(Dupontetal.，1996；Mehlmannetal.，1998；Wangetal.，1998)；在精子中檢測到β1～3、γ1，2、δ2、δ4和ζ的表達(Mehlmannetal.，1998；Fukamietal.，2001；Wuetal.，2001；Albaetal.，2002；Parringtonetal.，2002)。受精和卵子激活是胚胎發(fā)育的第一步，研究發(fā)現(xiàn)，PLC-δ4和PLC-γ與這一現(xiàn)象密切相關，PLC-δ4基因敲除小鼠表現(xiàn)出雄性不育，且體外受精實驗發(fā)現(xiàn)，這些動物的精子僅能夠誘導較少卵子的激活，并且不會引起鈣振蕩(Fukamietal.，2001)。由于鈣振蕩增加是啟動卵子激活的關鍵，而PLC-δ4是精子中誘導鈣振蕩和卵子激活的重要基因(Wassarman，1999)。PLC-β的分布非常廣，在神經系統(tǒng)、感覺器官及腺體的表達量顯著高于其他位置。成熟小鼠卵細胞在mRNA水平上表達2種PLCβ同工酶β1和β3(Dupontetal.，1996)。PLCβ3缺陷的胚胎在第4細胞期前死亡，表明該酶參與卵子激活或早期胚胎發(fā)育(Wangetal.，1998)。在成年小鼠中，PLC-β4在蒲肯野細胞、丘腦、中隔及眼睛的視桿細胞有高表達(Watanabeetal.，1998)。小腦皮層中層的蒲肯野細胞中，PLC-β4高表達，敲除后小鼠會出現(xiàn)運動失調(Kimetal.，1997)。而小鼠丘腦皮質PLCβ4缺失則會導致其失神發(fā)作(Cheongetal.，2009)。PLCβ4與小腦發(fā)育過程中的纖維突觸清除有關(Kanoetal.，1998)。PLCβ4在大腦發(fā)育和發(fā)揮正常功能中起著不可替代的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，丘腦mGluR1-PLCβ4通路是控制睡眠結構的關鍵(Hongetal.，2016)。在渦蟲胚胎發(fā)育的第3階段檢測到DjPLCβ4基因在胚胎咽出現(xiàn)信號，之后在分化出的神經原基和咽原基中也檢測到陽性信號，隨著胚胎腹部神經加厚并豐富，陽性信號增多，且頭部更加明顯。DjPLCβ4基因主要集中在成體的腦和咽。因此，DjPLCβ4基因在渦蟲胚胎發(fā)育時主要參與渦蟲神經原基的形成和分化。