徐 彬，楊清峰，趙小玉，余元?jiǎng)?，李建平，?萍，冷雪峰，王迎新

在全球，乳腺癌是女性惡性腫瘤中發(fā)病率與死亡數(shù)最高的腫瘤，每年乳腺癌新發(fā)病例約167.1萬(wàn)，死亡病例約52.2 萬(wàn)[1]；中國(guó)乳腺癌發(fā)生率占全球發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)的11.2%和9.2%，乳腺癌的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高[2]。近年來(lái)分子生物液體活檢在乳腺癌篩查、監(jiān)測(cè)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中有較大進(jìn)展，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是目前生物液體活檢中應(yīng)用較多的療效監(jiān)控的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè) CTCs 有其無(wú)創(chuàng)性、可重復(fù)性、時(shí)效性的特點(diǎn)[3]。CTCs檢測(cè)技術(shù)常用的Cell Search系統(tǒng)，已被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)可應(yīng)用于臨床檢測(cè)，計(jì)數(shù) CTCs 作為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)后生物標(biāo)志物[4]，但單一標(biāo)志物容易造成部分 CTCs 會(huì)被漏檢[5]，故聯(lián)合其他標(biāo)志物，是提高CTCs檢測(cè)的敏感度、特異度的重要方法。血液中的乳腺癌CTCs能表達(dá)5種多巴胺受體(dopamine receptor，DR)(DRD1,DRD2,DRD3,DRD4,DRD5)[6]等，但在正常造血干細(xì)胞不表達(dá)；DR有可能成為檢測(cè)血中CTCs的生物標(biāo)志物。已有學(xué)者正在研發(fā)DR調(diào)節(jié)劑，以進(jìn)行乳腺癌治療試驗(yàn)[7]。

現(xiàn)在經(jīng)常用差相富集-免疫熒光原位雜交技術(shù)(subtraction enrichment and immunostaining fluorescence in situ hybridization，SE-iFISH)檢測(cè)CTCs，同時(shí)聯(lián)合熒光定量PCR技術(shù)(fluorescent quantitative PCR，Q-PCR)檢測(cè)CTC多巴胺受體表達(dá)水平，探索其在乳腺癌監(jiān)測(cè)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料樣本隨機(jī)選取自2018年4月～2019年5月安徽省婦幼保健院就診患者，均為安徽漢族人，共計(jì)40例；SE-iFISH測(cè)試組包括：① 20例健康體檢女性，年齡41～55(48.7±6.16)歲；② 20例為治療前乳腺癌女性，均未接受相關(guān)治療，年齡48～69(55.6±8.21) 歲。另在20例治療前乳腺癌女性中選取6例乳腺癌患者為術(shù)后觀察組。參與研究者，均簽署知情同意書。

對(duì)SE-iFISH測(cè)試組，采集外周血7.5 ml、ACD抗凝，應(yīng)用SE-iFISH 檢測(cè)CTCs，評(píng)判檢測(cè)的靈敏度、特異度。再在術(shù)后3、6個(gè)月對(duì)觀察組6例乳腺癌患者進(jìn)行外周血采集、SE-iFISH 檢測(cè)CTCs、Q-PCR檢測(cè)CTC DRD1。

1.2 SE-iFISH檢測(cè)SE-iFISH 檢測(cè)CTCs的試劑盒，由賽特生物醫(yī)藥科技有限公司提供，具體操作步驟基本如下：

采集7.5 ml外周靜脈血到ACD抗凝管中。2 000 r/min離心8 min，去除血漿；在離心管中，加入3 ml密度梯度分離液，離心并去除該分離液上疊加的紅細(xì)胞。再1 800 r/min離心8 min，將含白細(xì)胞和CTCs的液層，吸到另一離心管中，加200 μl磁珠，搖床搖動(dòng)室溫孵育20 min后，1 800 r/min離心8 min，去除白細(xì)胞和磁珠，CTCs混合液移到15 ml離心管中。加入抗原修復(fù)液修復(fù)抗原后，再加入anti-D45抗體與anti-CK18抗體、 抗體稀釋液的混合液，室溫避光孵育20 min，2 500r/min離心5 min，棄大部分上清液至余下100 μl，沉淀細(xì)胞后，加入100 μl固定液混勻、涂片，32 ℃過(guò)夜烘干玻片。在玻片進(jìn)行原位CEP8探針雜交。最后滴加5 μl DAPI染液封片并于熒光顯微鏡下觀察。

結(jié)果判讀：CTCs的表型為：CK+/CD45-/DAPI+/CEP8+=2；CK+/CD45-/DAPI+/CEP8+>2；CK-/CD45-/DAPI+/CEP8+>2。

1.3 CTCs DR Q-PCR檢測(cè)采集7.5 ml外周靜脈血到ACD抗凝管中。按照上述步驟去除血漿、紅細(xì)胞、白細(xì)胞后，將含有CTCs的細(xì)胞混合液，通過(guò)細(xì)胞總RNA提取試劑盒(DP430)，進(jìn)行CTCs的RNA抽提，然后用Quant one step qRT-PCR Kit(SYBR Green，F(xiàn)P303)進(jìn)行 Q-PCR檢測(cè)。引物序列見表1。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 相關(guān)引物序列

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌術(shù)后患者CTCs計(jì)數(shù)與臨床病理特征的關(guān)系CTCs的計(jì)數(shù)與乳腺癌的分子分型有關(guān)(P=0.007)，但與患者的年齡、腫瘤分期、組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、ER、PR、HER-2、Ki-67 表達(dá)情況無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表 2。

表2 20例乳腺癌術(shù)后患者CTC計(jì)數(shù)與臨床

2.2 SE-iFISH在乳腺癌外周血CTCs檢測(cè)中有較高的靈敏度、特異度結(jié)果顯示，20例健康人CTCs的檢出率為0。而隨機(jī)選取的20例治療前乳腺癌患者中，18例檢出了CTCs(90.0%)，其平均值為7.85 CTCs/7.5 ml外周血(圖1A、B、C)。說(shuō)明該檢測(cè)方法靈敏度、特異度較好，適合本研究應(yīng)用。

2.3 DRD1在乳腺癌CTCs上的表達(dá)量比DRD2、DRD3和DRD4更高結(jié)果顯示，20例乳腺癌患者CTCs細(xì)胞的DRD 平均CT值：DRD1為21.60、DRD2 為40.02、DRD3為32.62、DRD4為41.40，對(duì)照GAPDH為18.68(圖2)。與DRD2、DRD3和DRD4的反應(yīng)CT值比，DRD1的反應(yīng)CT值較高，可能較適合本實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 SE-iFISH檢測(cè)CTCs結(jié)果 ×400(merge即合并圖)

A：20例治療前乳腺癌患者7.5 ml外周血的CTCs檢出值；B圖：CTCs細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果；C：紅細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果；橙色：CEP8染色；紅色：CD45染色；綠色：CK18染色；藍(lán)色：DAPI染色

圖2 乳腺癌CTCs細(xì)胞的DRD1、DRD2、DRD3

2.4 聯(lián)合CTCs、CTC DRD1表達(dá)量檢測(cè)對(duì)乳腺癌監(jiān)控有較好的效果為了研究CTCs和CTCs DRD1表達(dá)量在乳腺癌病情進(jìn)展中的變化，選擇6例治療前乳腺癌患者(患者1、2、6為T3期，患者3、4、5為T2期)進(jìn)入術(shù)后觀察組，進(jìn)行術(shù)后3、6個(gè)月時(shí)的外周血采集、SE-iFISH 檢測(cè)CTCs結(jié)果見圖3、Q-PCR檢測(cè)CTCs DRD1見圖3；同時(shí)結(jié)合臨床B超、CT檢查，觀察患者乳腺癌療效、進(jìn)展情況。

圖3 患者1、2、3、4、5、6術(shù)前、術(shù)后3、6個(gè)月CTCs數(shù)值

總體看，結(jié)果分兩類：第一類是T2期的患者3、4、5的CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct都呈下降趨勢(shì)(圖4)；臨床CT、B超等的后續(xù)監(jiān)控結(jié)果也顯示預(yù)后良好。第二類是T3期的患者1、2、6的CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct開始呈下降趨勢(shì)，后來(lái)呈上升趨勢(shì)(圖4)，后續(xù)監(jiān)控發(fā)現(xiàn)第二類患者病情預(yù)后不良，并發(fā)生轉(zhuǎn)移?？傮w看，兩類患者 CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct與T分期、乳腺癌進(jìn)展有較好的一致性，可以有效輔助臨床監(jiān)控。

3 討論

Cell Search平臺(tái)檢測(cè)的CTCs數(shù)量變化對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者有預(yù)后價(jià)值，可評(píng)估轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)療效，指導(dǎo)個(gè)體化用藥，Yu et al[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血常含有間質(zhì)細(xì)胞表型的CTCs，并能通過(guò)上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化遷入血循環(huán)，其中含有少數(shù)有高度轉(zhuǎn)移潛能的CTCs，在腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、進(jìn)展中有重要作用。乳腺癌患者外周血中CTCs數(shù)量極少，約為單個(gè)核細(xì)胞數(shù)目的 1/105[9]，因此要有高度特異和靈敏的CTCs檢測(cè)方法。本研究通過(guò)SE-iFISH CTCs檢測(cè)，20例健康人CTCs的篩查結(jié)果為0，而20例治療前的乳腺癌患者的CTCs有90%的檢出陽(yáng)性率，說(shuō)明該方法靈敏度和特異度較好，對(duì)后續(xù)鑒定所使用標(biāo)志物的選擇更為靈活。

圖4 患者1、2、3、4、5、6術(shù)前、術(shù)后3、6個(gè)月CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct監(jiān)控統(tǒng)計(jì)圖

Giordano et al[10]分析發(fā)現(xiàn)，CTCs能預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存率，外周血CTCs數(shù)量與患者的轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后不良相關(guān)。乳腺癌患者在接受有效治療后，血中CTCs數(shù)量會(huì)減少。Jiang et al[11]對(duì)294例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者研究證實(shí)，CTCs在我國(guó)轉(zhuǎn)移性乳腺癌監(jiān)控中有應(yīng)用價(jià)值，115例患者中，檢出CTCs≥5/7.5 ml，CTCs數(shù)量增加與轉(zhuǎn)移相關(guān)。CTCs已被寫入美國(guó)AJCC指南(第八版)和2019年中國(guó)乳腺癌診治指南，作為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)之一。對(duì)血CTCs的篩查，有利于發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)療效、評(píng)估預(yù)后[12]。

Sachlos et al[13]發(fā)現(xiàn)，DR可能是乳腺癌腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)的生物標(biāo)志物，DR在有5種(正常乳腺干細(xì)胞不表達(dá))，參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，DR拮抗劑硫利達(dá)嗪、三氟拉嗪，能抑制CSCs細(xì)胞膜的D2受體，抑制CTCs增殖；提示其外周血CSCs的DR是較理想的標(biāo)志物，與乳腺癌治療、預(yù)后相關(guān)，約30% 晚期乳腺癌表達(dá)DRD1，常有更大腫瘤、更多淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更短生存[14]。CTCs DRD1的表達(dá)量更高，本實(shí)驗(yàn)選取檢測(cè)DRD1。

在進(jìn)行乳腺癌病情監(jiān)控時(shí)，因各種原因一些受試者未進(jìn)行多次檢測(cè)，只有術(shù)前檢測(cè)數(shù)據(jù)，僅6例乳腺癌患者做了術(shù)后3、6個(gè)月的DRD1血水平檢測(cè)。從檢測(cè)總體結(jié)果看，T3期的患者其CTCs和CTC DRD1 術(shù)前檢出值比T2期患者的高；6個(gè)月時(shí)復(fù)查檢出CTCs較多、CTCs DRD1水平升高，后續(xù)發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移，且預(yù)后不良。T2期患者6個(gè)月復(fù)查檢出CTCs較少、CTCs DRD1水平降低，其后續(xù)預(yù)后良好，目前沒有復(fù)發(fā)跡象。但因入組人數(shù)較少，監(jiān)控次數(shù)較少，后續(xù)還需要繼續(xù)入組更多的患者，并對(duì)其疾病進(jìn)展進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控，從而獲得更多的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行更加精確的分析以明確CTCs DRD1檢測(cè)對(duì)乳腺癌患者臨床應(yīng)用的價(jià)值，為乳腺癌DR靶向藥的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)，研究中患者的隨訪工作還在進(jìn)行中。