史亞婷 劉文賓 吳迪炯 沈一平 周郁鴻 葉寶東

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種以全血細胞減少、骨髓造血功能衰竭為特征的血液病，其發(fā)病機制尚未明確。目前認為免疫機制異常、造血微環(huán)境改變和造血干細胞缺陷是其三大原因［1］，其中造血微環(huán)境異常在其發(fā)病中的作用越來越受到重視。作者前期研究發(fā)現(xiàn)AA 患者骨髓微血管密度（MVD）顯著低于正常人［2］，且重型AA 更顯著，低血管密度勢必會影響骨髓血供，對造血細胞的成熟與分化不利。而骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是骨髓微環(huán)境的重要組成部分，與造血細胞直接接觸，起到支持和營養(yǎng)造血細胞的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)無論腎陽虛還是腎陰虛再障患者，BMSCs 的增殖能力較正常對照減弱［3］。再障的基本中醫(yī)病機為腎虛髓虧，因虛證、瘀證而發(fā)病，一定程度上與現(xiàn)代認識的微循環(huán)相契合［4］，同時應用補腎活血法取得較好的臨床療效［5］。本文探討補腎活血法對再生障礙性貧血患者BMSCs 增殖和成血管作用的影響，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 補腎活血中藥處方：太子參30g，補骨脂20g，仙靈脾20g，肉桂4g，生地15g，熟地20g，茯苓10g，菟絲子15g，制何首烏10g，丹參10g，當歸10g，赤芍9g，丹皮9g，山藥30g，均選取江陰天江藥業(yè)有限公司標準中藥顆粒劑。

1.2 實驗動物 周齡雄性SPF 級荷蘭兔，體重2~3kg，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.3 制備含藥血清及對照血清 將212g×6 包原生藥加一定量的水，用水提法濃縮成1000ml 液體。隨機將6 只兔子分成兩組，對照血清組予灌胃生理鹽水20ml/次，2 次/d，共7d；含藥血清組予每次灌胃中藥湯液20ml，2 次/d，共7d。從實驗第4 天起，每天分別對2 組兔子在第2 次灌胃2h 后耳靜脈取10ml 全血，后立即離心，每組獲得約5ml 血清。將4 次血清混合后，每組共獲得約20ml 血清，置于水浴箱中56℃，30min 滅活，0.22μm 過濾器過濾除菌，分裝至15ml 離心管中，-20℃冷藏備用。

1.4 再障患者BMSCs 的獲取 選取2018 年6 月1 日至12 月31 日本院血液內(nèi)科住院的初發(fā)AA 患者8 例，其中男4 例，女4 例；中位年齡26（18~46）歲。病例診斷均符合再生障礙性貧血診斷與治療中國專家共識（2017 年版）［6］。所有患者均知情同意，簽署知情同意書。常規(guī)抽取再障患者骨髓5~10ml，采用已經(jīng)建立的骨髓MSCs 提取方法［3］，采用流式細胞術鑒定MSCs，取3 ～6 代細胞進行后續(xù)研究。

1.5 主要儀器與試劑 多功能全波長酶標儀（K3），美國Thermo 公司；8μm 孔徑 transwell 裝置，Corning Coster Corp 公司。

1.6 CCK8 檢測補腎活血法對再障患者BMSCs 增殖的影響 （1）取生長狀態(tài)良好的P3 代細胞，以5×103密度接種于96 孔板中，每孔200μl。（2）無血清培養(yǎng)24h 后，分成12 組，分別為5%、10%、15%、20%、25%、30% 含 藥 血 清 組 和5%、10%、15%、20%、25%、30%對照血清組每組5 個復孔，培養(yǎng)24h、48h、72h 后， 加 入CCK8 溶 液10μl/ 孔，5% CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h。（3）取出96 孔板，低速震蕩15min，酶標儀570nm 波長檢測吸光度（OD）值。

1.7 Transwell 檢測補腎活血法對重型再障患者BMSCs體外遷移的影響 （1）取生長良好的P3 代BMSCs 細胞，無血清培養(yǎng)24h 后，分成12 組，分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%含藥血清組和對照血清組，予對應血清濃度預處理24h。（2）調(diào)整各組細胞密度為5×105/ml，在transwell 下室加入含100μg/ml SDF-1 培養(yǎng)液；上室分別加預處理后的各組細胞懸液200μl。置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育6h。（3）取出transwell 裝置，PBS 洗滌，置于4%多聚甲醛中固定 15min。（4）PBS 洗滌3 次后，將transwell 裝置置于0.1%結晶紫溶液中染色15min。（5）棄染色液，PBS 洗滌3次，自然晾干，棉簽拭去小室上層細胞。（6）倒置相差顯微鏡觀察小室下層細胞。（7）將transwell 小室置于200μl 結晶紫脫色液中脫色30min。酶標儀570nm波長檢測脫色液吸光度（OD）值。

1.8 Western Blot 檢測誘導后細胞血管內(nèi)皮細胞標志表達 （1）取生長良好的P3-P5 代再障BMSCs 予含VEGF10ug/LDMEM 培養(yǎng)基預處理24h。（2）分別搜集25%含藥血清和25%對照血清誘導1d、3d、5d、7d細胞于EP 管中，加入1 ∶100 混勻的含蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液混合液100μl，震蕩混勻，予冰上裂解1h。4℃以12000r/min 離心15min。棄上清液，加入100μl 蛋白上樣緩沖液，取少量測定蛋白濃度，繪制標準曲線，剩余蛋白予98℃水浴加熱10min，存入-80℃冰箱備用。（3）按試劑盒操作說明進行CD31、Tie-2蛋白測定。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件。計量資料以（±s）表示，兩組比較采用t 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 補腎活血含藥血清對BMSCs 增殖影響 與對照血清組比較，10%和25%含藥血清培養(yǎng)24h，5%、15%和25%含藥血清培養(yǎng)48h，各濃度培養(yǎng)72h 對BMSCs 增殖具有明顯促進作用（P<0.05）。含藥血清對BMCs 增殖促進作用與時間呈一定依賴關系，24h 與48h 作用相似，但72h 明顯增強。與對照血清組比較，25%含藥血清濃度在各時間段的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），因此選擇25%含藥血清濃度為后續(xù)形態(tài)學觀察和WB 檢測血管內(nèi)皮細胞標志實驗濃度，見圖1~3。

注：與對照血清組比較，*P<0.05

圖2 補腎活血含藥血清對BMSc增殖影響（48h）

圖3 補腎活血含藥血清對BMSc增殖影響（72h）

2.2 補腎活血含藥血清對BMSCs 體外遷移的影響 應用上述Transwell 裝置重復實驗5 次，結果顯示：不同濃度對照血清及含藥血清組均可見梭形結晶紫染色BMSCs，其中15%、20%、25%、30%含藥血清組較其他組細胞數(shù)較多，對照血清各濃度組相似。脫色后測得OD 值統(tǒng)計分析結果示：與對照血清組比較，5%、10%含藥血清OD 值相似差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），15%、20%、25%、30%含藥血清OD 值較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），15%、20%、25%、30%含藥血清促進作用相似，無明顯濃度依賴關系，見圖4。

圖4 補腎活血含藥血清對BMSCs體外遷移的影響

2.3 含藥血清誘導后形態(tài)觀察 25%含藥血清誘導1d 后，BMSCs 形態(tài)未見明顯改變，仍呈長梭形生長，排列緊密，誘導7d 后細胞間距增大，排列松散，胞體呈多角形或不規(guī)則形。含藥血清誘導21d 可見少量管腔樣結構形成。25%對照血清21d 形態(tài)無改變。見圖5。

圖5 不同含藥血清誘導后BMSCs形態(tài)的變化

2.4 WB 檢測血管內(nèi)皮細胞標志 25%含藥血清誘導1d 后有少量CD31、Tie-2 蛋白，后隨著時間延長，表達量逐漸增多，25%對照血清誘導7d 后未見CD31、Tie-2 蛋白表達，見圖6。

圖6 WB檢測血管內(nèi)皮細胞表面標志（CD31和Tie-2）表達

3 討論

骨髓造血微環(huán)境（BMHM）是造血細胞直接的生存環(huán)境，其主要作用是為造血細胞運輸氧氣、營養(yǎng)成分、信號因子，同時運輸代謝廢物，是其生存和健康發(fā)育必備條件之一。骨髓微血管是BMHM 的場所，其生成受多種因子的聯(lián)合影響，取決于促血管形成因子與血管抑制因子的作用偏傾。目前已經(jīng)明確AA 患者的BMHM 受損，不過尚未明確是免疫因素導致其受損還是先有BMHM 受損，或二者相互作用而導致AA 發(fā)生。前期研究發(fā)現(xiàn)AA 患者骨髓微血管密度（MVD）顯著低于正常人［2］，且重型AA 更顯著，低血管密度勢必會影響骨髓血供，對造血細胞的成熟與分化不利。造血細胞的增殖分化需要來自骨髓細胞自分泌及外周循環(huán)的各類因子的刺激，再障患者骨髓MVD 減少，與骨髓血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達減少相關［2，7］，且在免疫抑制劑或骨髓移植治療后，MVD 及VEGF 均顯著上升，但以免疫抑制劑的作用更明顯，可能與環(huán)孢菌素（CsA）直接刺激造血或非造血細胞分泌VEGF有關［8］。中藥藥理發(fā)現(xiàn)，活血化瘀類中藥能在一定程度上促進血管新生，故在此基礎上提出補腎固本兼以活血化瘀的基本治療方法，臨床療效亦得到提高［9-10］。相關分析顯示IL-2、IL-10、IL-4、IFN-γ 與骨髓MSCs 生成負相關，IL-6、TNF-α 呈正相關［11］，提示補腎活血法可能通過提高骨髓MSCs 粘附分子的表達水平，改善骨髓造血微環(huán)境，從而提高療效。在AA患者異基因造血干細胞移植過程中應用補腎健脾祛瘀法干預，發(fā)現(xiàn)補腎活血可以明顯提高移植物植入率，減少移植排斥［12］，可能也是與補腎健脾祛瘀改善患者骨髓微循環(huán)有關。

本實驗將再障BMSCs 分離并體外培養(yǎng)，觀察不同濃度含藥血清對再障BMSCs 增殖作用的影響，10%和25%含藥血清培養(yǎng)24h，5%、15%和25%含藥血清培養(yǎng)48h，各濃度培養(yǎng)72h 對BMSCs 增殖具有明顯促進作用（P<0.05）。含藥血清對BMSCs 增殖促進作用與時間呈一定依賴關系，24h 與48h 作用相似，但72h 明顯增強。與對照血清組比較，25%含藥濃度在各時間段均有意義（P<0.05）。通過體外誘導實驗發(fā)現(xiàn)，25%補腎活血含藥血清隨著時間的延長，能誘導BMSCs 向血管內(nèi)皮細胞分化，主要體現(xiàn)在細胞形態(tài)的變化和管腔樣結構的形成和血管內(nèi)皮細胞標志的出現(xiàn)。綜上，補腎活血法可能是通過促進再障患者BMSCs 的增殖以及向血管內(nèi)皮細胞分化來促進骨髓微血管的生成，從而作為補腎活血法改善骨髓微環(huán)境的機制之一。

AA 歸于中醫(yī)“虛勞”、“髓勞”、“血證”等范疇，目前認為先天肝腎不足、后天勞役失養(yǎng)，邪毒之氣乘虛而入是其主要的病因病機。治療上主張從腎論治，臨床療效得到提高，但是有部分患者的臨床療效并不理想，且對于重型或非重型再障、急性或慢性再障，中醫(yī)藥介入的時機和療效還有比較大的爭議。對于AA，在從腎論治的基礎上，如何進一步闡明其病因病機并相應的調(diào)整療法以提高療效，值得進一步探索。