禹思宇，周智君，譚建錫，胡憶文，唐連飛※

（1.長沙海關(guān)技術(shù)中心，湖南長沙410004；2.中南大學(xué)實驗動物學(xué)部，湖南長沙410008）

呼腸孤病毒3 型 (Reo3)為呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬的代表株。病毒粒子具有特征的二十面體對稱雙層衣殼結(jié)構(gòu)，成熟病毒無包膜,大小約75nm[1]。病毒基因組是分節(jié)段雙股RNA(dsRNA)，全基因組分為 L (L1、L2、L3)、M (M1、M2、M3)、S(S1、S2、S3、S4)3 組共 10 個節(jié)段基因組成[2]，編碼 8種結(jié)構(gòu)蛋白，3 種非結(jié)構(gòu)蛋白,共11 種蛋白[3]。呼腸孤病毒可以感染多種脊椎動物，包括馬、牛、豬、綿羊、豚鼠、犬、貓、貂、禽類、蝙蝠以及人、黑猩猩和猴，除了感染嚙齒動物和禽外，一般不引起明顯的疾病，特別是對成年動物。鼠類能自然感染Reo3，其臨床表現(xiàn)為黃疸、運動失調(diào)、油性被毛、生長發(fā)育遲緩等[4]。呼腸孤病毒在人類的某些呼吸道及消化道疾病的發(fā)生上，呈現(xiàn)一定的輔助或促進(jìn)作用,能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾病[5-6]。

呼腸孤病毒3 型是實驗動物SPF 級大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠的必檢項目，目前針對Reo3 的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）[7]，以及普通RT-PCR 方法[8]，這些方法在Reo3 的臨床檢測中發(fā)揮了一定的作用，但具有靈敏性不高、穩(wěn)定性差等限制。建立確定Reo3 感染的快速精確檢測方法在Reo3 診斷及流行病學(xué)調(diào)查中具有重要意義。熒光定量PCR 檢測方法具有快速、高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，在獸醫(yī)臨床的快速檢測中應(yīng)用廣泛。本研究擬建立一種Reo3 的快速檢測方法，為今后Reo3 篩查和監(jiān)控提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株

呼腸孤病毒3 型(Reo3)、小鼠肺炎病毒由上海海關(guān)技術(shù)中心提供，鼠肺炎病毒（PVM）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、古典豬瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹瀉粘膜病病毒（BVDV）核酸均為實驗室保存。

1.2 儀器與試劑

核酸自動提取儀MagNA Pure LC 2.0、480II 熒光定量PCR 儀及核酸提取試劑盒MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 購自 Roche 公司，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Ambion 公司，One-Step RT-PCR 試劑盒購自ABI 公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計及合成

根據(jù)NCBI 網(wǎng)站上的公布的呼腸孤病毒3 型(Reo3)全基因序列，將不同株M1 基因進(jìn)行比對，利用DANStar 軟件進(jìn)行序列比對分析，選取Reo3的M1 基因保守區(qū)序列作為引物設(shè)計的靶標(biāo)，并利用Primer Express 3.0.1 軟件設(shè)計特異性引物探針:Reo3-F1: 5'-GTGCATCATTCCGTTTGGTAAA-3'，Reo3-R1:5'-TGCCAACATTA AATCGAGAGTGA-3';Reo3-P：FAM-AGGTGGGTCGTGTTC-BHQ1。引物和探針由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

全自動核酸提取儀提取Reo3 的RNA 后，用反轉(zhuǎn)錄獲得的病毒cDNA 為模板，以M1 基因為靶標(biāo)進(jìn)行PCR 擴增，引物上游加入T7 啟動子序列。設(shè)計的引物序列分別為 Reo3-F2：ggatatgaggctggtgacgttat，Reo3-R2：ggatggactcaatatcaacccca。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證后，以PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系分別包括10×Reaction Buffer、ATP solution、CTP solution、GTP solution、UTP solution、Enzyme Mix 各 2μL；PCR 產(chǎn)物 0.1～0.2μg；加水至總體積20μL。37℃2～4 小時后在體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 2μL RNase-free DNase，37℃ 孵育 15min，除去DNA 模板。隨后用飽和酚-氯仿抽提去除殘留的DNase 和RNA 聚合酶。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品按照10 倍倍比稀釋，由此得到1.0×101～1.0×1010copy/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品，按照熒光RT-PCR 反應(yīng)體系及條件進(jìn)行擴增，以讀取的Ct值為Y 軸，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為X 軸，建立Reo3熒光PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 熒光定量RT-PCR反應(yīng)方法體系及反應(yīng)條件

配制熒光定量RT-PCR 反應(yīng)液，每管20μL：含 4×RT-PCR buffer 5μL，10 pmol/μL ，Reo3-F、Reo3-R 1μL，10 pmol/μL TaqMan 探 針 0.5μL，RNase Free dH2O 7μL，模板2μL。反應(yīng)條件為第一階段，45℃ 10min，95℃ 10min；第二階段為 95℃15sec，60℃ 45sec（收集熒光），40 個循環(huán)。

1.7 敏感性、特異性和重復(fù)性

以 1.0×101～1.0×1010copy/μL 10 個 10 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，根據(jù)上述已知反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR，評估該方法的敏感性；按照上述已知的反應(yīng)條件，以PVM、PRRSV、CSFV、BVDV、AIV 為模板，進(jìn)行熒光定量RT-PCR，同時以Reo3 ssRNA 作為陽性對照，細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對照，評估該方法的特異性。

以 1.0×106～1.0×108copy/μL 3 個 10 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個濃度重復(fù)三次實驗，檢測組間重復(fù)性。計算Ct 值變異系數(shù)，檢測PCR 體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 Reo3熒光PCR檢測方法標(biāo)準(zhǔn)品鑒定

利用Reo3 M1 部分基因片段設(shè)計并合成的引物進(jìn)行PCR 擴增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出片段大小523 bp 的特異性條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。

將片段回收純化，其序列結(jié)果與可以檢索到Reo3 的病毒株M1 片段一致，體外轉(zhuǎn)錄后抽提獲得的ssRNA，經(jīng)測定濃度為24 ng/μL，將之稀釋為2.95 ng/μL，拷貝數(shù)為 1×1010copy/μL，分裝備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立Reo3 熒光RT-PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品在1.0×101～1.0×1010copy/μL 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9990，表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)與Ct 值之間有很好的線性關(guān)系（如圖2），以熒光Ct 值為Y 軸，濃度的對數(shù)值為X 軸，由此得到的線性方程為：y=-2.170x+41.52。

2.3 Reo3熒光定量RT-PCR檢測方法的敏感性、特異性、重復(fù)性試驗

以 1.0×101～1.0×1010copy/μL10 個 10 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR，結(jié)果顯示該方法最低能檢測到1.0×102copy/μL Reo3，具有較高的檢測靈敏度。（圖 3）

以 Reo3、PVM 、PRRSV、CSFV、BVDV、AIV 為模板，根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR，同時設(shè)置陰性對照，結(jié)果顯示只有Reo 3具有特異性擴增曲線（如圖4），其他病毒模板和陰性對照均無擴增曲線，表明該方法對Reo3 具有良好的特異性。

以 1.0×106～1.0×108copy/μL 3 個 10 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個濃度重復(fù)三次實驗進(jìn)行組間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，Ct 值組間變異系數(shù)（CV）在0.54%～1.04%之間，均小于2%，表明該方法具有較好的重復(fù)性（如表1）。

表1 Reo3 熒光PCR 重復(fù)性實驗結(jié)果

3 討論

呼腸孤病毒（Reovirus，Reo）是一種人畜共患的病毒，Reo3 是該病毒屬的代表株。Reo3 可隱性感染動物并在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，從而給血液制品、單克隆抗體、細(xì)胞培養(yǎng)等外來致病因子的檢定及動物試驗帶來一定的困難[9]。實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測（GB 14922.2-2011）將Reo3 列為SPF 等級實驗動物必須排除的病原微生物[10]。目前針對Reo3 的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）[7]，以及普通RT-PCR 方法[8]，這些方法在Reo3 的臨床檢測中發(fā)揮了一定的作用，但具有靈敏性不高、穩(wěn)定性差等限制。因此，建立一種方便、快速、靈敏的的檢測方法對于Reo3 的診斷非常必要。

本實驗所建立的Reo3 實時熒光RT-PCR 檢測方法，特異性試驗結(jié)果顯示，該方法除對Reo3 有擴增反應(yīng)外，對其它相關(guān)病毒均無擴增反應(yīng)，引物具有良好的特異性；通過敏感性實驗，可以看出標(biāo)準(zhǔn)品濃度在 1.0×102～1.0×1010copy/μL 之間時，其濃度的對數(shù)值與熒光定量RT-PCR 實驗中的Ct 值之間有良好的線性相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R2=0.9990），且該標(biāo)準(zhǔn)品檢出限為1.0×102個copy/μL。同時，該方法實驗間的變異系數(shù)為0.54%～1.04%之間，均小于2%，表明該方法擴增穩(wěn)定性高、重復(fù)性強。

本實驗所建立的Reo3 熒光定量RT-PCR 檢測方法特異、敏感、可靠，穩(wěn)定性好，檢測的準(zhǔn)確性高，可為實驗動物中Reo3 的監(jiān)測以及流行病學(xué)研究提供特異、敏感、快速的方法。