（貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004）

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷，即推斷死后經(jīng)歷或間隔時(shí)間，是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中需要解決的重要問題之一[1-2]。PMI推斷常根據(jù)尸體現(xiàn)象、尸體化學(xué)、微生物學(xué)、昆蟲學(xué)等變化規(guī)律[1，3]。近年來，隨著法醫(yī)生物力學(xué)的發(fā)展，利用大鼠、家豬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體血管、腸管、肌肉、腦組織等軟組織材料的生物力學(xué)時(shí)序性變化進(jìn)行PMI推斷的研究已有報(bào)道[4-7]，但是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體相比在組織結(jié)構(gòu)上存在較大差異，其實(shí)用性有待進(jìn)一步研究。

硬腦膜與顱蓋骨及顱底骨內(nèi)面相鄰，位于與外界相對(duì)隔離的封閉顱腔內(nèi)，在人死亡后受溫度、濕度等外界環(huán)境因素影響相對(duì)較小[8]，因此人死后硬腦膜的生物力學(xué)特性變化更能反映其組織的變化特征，用于PMI推斷具有自身優(yōu)勢(shì)。此外，與人尸體血管、肌肉組織等同樣受環(huán)境因素影響較小的組織材料相比，硬腦膜具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1）硬腦膜主要由膠原纖維組成，不易受血液中外源性成分如乙醇、毒（藥）物等的影響，更能體現(xiàn)組織自身特性[9]；（2）硬腦膜面積較大，取材更方便，試件制作定位更為準(zhǔn)確，加之纖維排列和走向更具有規(guī)律，不同個(gè)體間更具有可比性。

本研究基于硬腦膜自溶、腐敗破壞其組織結(jié)構(gòu)以及影響其生物力學(xué)性狀的原理[5]，研究硬腦膜厚度及生物力學(xué)參數(shù)的時(shí)序性變化，以期用于PMI推斷。

1 材料與方法

1.1 樣本與分組

收集貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)司法鑒定中心2016年4月—2019年2月受理的法醫(yī)病理學(xué)鑒定案例中人尸體硬腦膜標(biāo)本，共148例。其中137例為實(shí)驗(yàn)組，平均年齡41.3歲；11例為驗(yàn)證組，平均年齡46.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）死亡時(shí)間在4 d內(nèi)的尸體；（2）男性，年齡為30～50歲；（3）排除開放性顱腦損傷案例以及尸體檢驗(yàn)證實(shí)硬腦膜有畸形、破裂、壞死、血管硬化或其他病變等異常硬腦膜標(biāo)本；（4）案例中死者均經(jīng)系統(tǒng)尸體解剖檢驗(yàn)鑒定。納入案例中死者的死亡原因主要為心血管疾病猝死和機(jī)械性損傷。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)獲得死者家屬同意并簽署知情同意書。

將收集到的實(shí)驗(yàn)組硬腦膜樣本根據(jù)PMI分為6h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h、96h組并取材，將硬腦膜樣本置于冰塊泡沫盒（-4～4℃）內(nèi)保存，2h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室備檢（表1）。

1.2 形態(tài)及力學(xué)參數(shù)檢測(cè)

將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的硬腦膜標(biāo)本統(tǒng)一于額部距冠狀縫1cm、距中線1cm處切取4.0cm×1.0cm的A、B兩塊試件（圖1）。其中，A試件經(jīng)測(cè)量厚度后進(jìn)行拉伸試驗(yàn)；B試件經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后制作切片，HE染色后在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

表1 硬腦膜樣本分組情況Tab.1 Grouping of the dural samples

圖1 硬腦膜試件取材部位示意圖Fig.1 Schematic diagram of the test specimen of dura

利用帶表測(cè)厚規(guī)（0-10*30型，義烏市開拓五金有限公司）測(cè)量硬腦膜A試件厚度，分別測(cè)量兩端和中間3處，取其均值。利用電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)（KDII-0.2型，深圳市凱強(qiáng)利試驗(yàn)儀器有限公司）檢測(cè)極限載荷（ultimate load，UL）、最大力變形（maximum force deformation，MFD）、抗拉強(qiáng)度（tensile strength，TS）、彈性模量（elastic modulus，EM）、斷裂力（fracture force，F(xiàn)F）等生物力學(xué)參數(shù)，分別以厚度和各生物力學(xué)參數(shù)為自變量（x），PMI為因變量（y）建立回歸方程，分析各參數(shù)與PMI的相關(guān)性。

拉伸試驗(yàn)在空調(diào)房內(nèi)進(jìn)行，室溫設(shè)置為25℃，濕度維持50%～60%。應(yīng)用電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)上、下兩端夾持硬腦膜試件各1 cm，保持自然平直，標(biāo)距為20 mm。加載參數(shù)設(shè)置[5]：（1）采用速度控制，試驗(yàn)速度為20 mm/min，速度方向及傳感器方向均為正向；（2）運(yùn)行條件為預(yù)加載力=0.5 N；（3）停機(jī)條件為后一個(gè)力值小于前一個(gè)力值的0.8倍。采用縱向單軸拉伸試驗(yàn)對(duì)硬腦膜進(jìn)行拉伸，試驗(yàn)前對(duì)試件進(jìn)行3次預(yù)調(diào)，達(dá)到穩(wěn)定的力學(xué)狀態(tài)后開始正式拉伸試驗(yàn)。試驗(yàn)機(jī)系統(tǒng)軟件自動(dòng)采集和記錄極限載荷、最大力變形、抗拉強(qiáng)度、彈性模量、斷裂力等生物力學(xué)參數(shù)。

1.3 回代檢驗(yàn)

取驗(yàn)證組11例的硬腦膜標(biāo)本，同上述方法處理，測(cè)量厚度和生物力學(xué)參數(shù)，將各參數(shù)代入擬合的回歸方程計(jì)算硬腦膜來源尸體的PMI（預(yù)測(cè)值），將預(yù)測(cè)值和實(shí)際值進(jìn)行比較，觀察兩者間差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以表示。將硬腦膜厚度和各生物力學(xué)參數(shù)（x）分別與PMI（y）進(jìn)行回歸分析，并對(duì)回歸方程進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)?；卮鷻z驗(yàn)中，驗(yàn)證組預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 硬腦膜的組織病理學(xué)改變

死后6～96h，隨著PMI的延長，硬腦膜從淡紅色、有光澤逐漸變?yōu)榛疑?、無光澤，鏡下硬腦膜厚度逐漸減小，膠原纖維呈現(xiàn)從排列清晰逐漸變?yōu)橄嗷ト诤?，?xì)胞核數(shù)量逐漸變少（圖2）。

圖2 硬腦膜組織隨PMI的時(shí)序性變化（HE×100）Fig.2 Histopathological changes of the dura at the different PMI

2.2 硬腦膜的厚度變化

隨著PMI的延長，硬腦膜平均厚度從（0.49±0.06）mm降至（0.39±0.05）mm，呈時(shí)序性下降趨勢(shì)，與PMI呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.883，P＜0.05）。以厚度為自變量（x）、PMI為因變量（y）建立的回歸方程為y=434.975-906.904x（R2=0.780，F(xiàn)=31.917，P＜0.05）。

2.3 生物力學(xué)參數(shù)隨PMI的變化

死后6～96 h，尸體硬腦膜組織的極限載荷、最大力變形、抗拉強(qiáng)度、彈性模量、斷裂力等各項(xiàng)生物力學(xué)參數(shù)均符合總體方差齊性，服從正態(tài)分布。隨著PMI的延長，極限載荷從（54.9±5.8）N降至（44.7±13.7）N、彈性模量從（63.6±11.9）MPa降至（38.6±18.6）MPa、斷裂力從（37.8±12.5）N降至（16.5±15.3）N，3個(gè)參數(shù)均呈降低趨勢(shì)，總體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與PMI呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.238、-0.320、-0.274，P＜0.05）；抗拉強(qiáng)度從（13.1±4.2）MPa降至（10.6±2.4）MPa，呈降低趨勢(shì)，但與PMI無相關(guān)性（r=-0.157，P=0.097）；最大力變形從（5.9±1.4）cm降至（5.3±0.9）cm，未見明顯變化趨勢(shì)，與PMI無相關(guān)性（r=0.018，P=0.848）。

以極限載荷（x1）、彈性模量（x2）、斷裂力（x3）為自變量，PMI為因變量（y）的線性回歸方程，以及上述變量與PMI擬合所得的多元線性回歸方程見表2。

表2 各生物力學(xué)參數(shù)隨PMI變化的回歸方程及其統(tǒng)計(jì)量Tab.2 Regression equation between biomechanical parameters and PMI in dura after death

2.4 回代檢驗(yàn)

通過擬合所得的厚度回歸方程計(jì)算預(yù)測(cè)值與實(shí)際值最大相差3.07 h，最小相差0.59 h。通過生物力學(xué)參數(shù)多元線性回歸方程計(jì)算預(yù)測(cè)值與實(shí)際值最大相差3.46 h，最小相差0.78 h。配對(duì)樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，PMI預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 回代檢驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Return test results （h）

3 討 論

PMI推斷在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中具有重要作用，尤其對(duì)于刑事案件，可以確定犯罪嫌疑人有無作案時(shí)間，縮小偵查范圍。盡管多種研究方法包括尸體變化、組織病理學(xué)變化、死后化學(xué)、分子方法、微生物分析、眼部變化、放射照相、昆蟲學(xué)和其他方法都被用于PMI推斷研究[3，10]，但PMI推斷的準(zhǔn)確性并沒有得到顯著提高。近年來，有學(xué)者[5-7]利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物軟組織生物力學(xué)變化特性研究PMI推斷，取得了一些成果。目前，硬腦膜用于法醫(yī)學(xué)PMI推斷方面的研究報(bào)道較少[11-13]。因此，本研究選取硬腦膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生物力學(xué)參數(shù)檢測(cè)。

本研究中，硬腦膜組織隨PMI的延長，顏色從淡紅色逐漸變?yōu)榛疑?，光澤度逐漸降低，呈現(xiàn)隨自溶、腐敗進(jìn)展而出現(xiàn)的時(shí)序性形態(tài)學(xué)變化趨勢(shì)[1]，與石學(xué)志等[7]報(bào)道的豬胸主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)觀察與PMI呈相關(guān)性研究結(jié)論一致。硬腦膜主要由膠原纖維組成，且隨PMI的延長，纖維逐漸變薄、從清晰逐漸融合，細(xì)胞核減少甚至消失，提示硬腦膜試件生物力學(xué)參數(shù)的時(shí)序性變化具有形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

極限載荷為試件被拉伸全過程中某時(shí)間點(diǎn)受力的最大值。彈性模量即單位面積承受的力，為衡量材料產(chǎn)生彈性變形難易程度的指標(biāo)，其值越小，材料剛度越小。斷裂力為試件被拉伸斷裂時(shí)瞬間受力的值。研究[13]結(jié)果表明，極限載荷、彈性模量、斷裂力等生物力學(xué)性狀參數(shù)均是直接反映組織生物力學(xué)特性的指標(biāo)，受組織各向異性、黏彈性影響較小，加之本研究截取試件時(shí)均取同一部位、同一方向、同一長寬規(guī)格的硬腦膜組織，因此，應(yīng)用極限載荷、彈性模量、斷裂力這3個(gè)指標(biāo)可較好地推斷PMI。

本研究拉伸試驗(yàn)結(jié)果表明，人尸體硬腦膜試件的極限載荷、彈性模量、斷裂力等生物力學(xué)參數(shù)與PMI呈負(fù)相關(guān)，取已知PMI的硬腦膜標(biāo)本，按規(guī)定處理檢材后進(jìn)行拉伸試驗(yàn)得出生物力學(xué)參數(shù)，代入建立的硬腦膜各生物力學(xué)參數(shù)與PMI之間的回歸方程進(jìn)行回代檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過方程計(jì)算的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明極限載荷、彈性模量和斷裂力這3個(gè)指標(biāo)可用于推斷PMI。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗拉強(qiáng)度與PMI未見相關(guān)性，提示該參數(shù)不適用于PMI推斷。最大力變形與PMI總體亦無明顯變化趨勢(shì)（P＞0.05），因最大力變形=試件末長度-試件初長度（ΔL=L-L0），本研究生物力學(xué)試驗(yàn)硬腦膜初長度L0已設(shè)置為2.0 cm，試驗(yàn)結(jié)束返回后試件末長度L與探頭移動(dòng)距離相關(guān)，故最大力變形參數(shù)因試驗(yàn)達(dá)到極限載荷的距離不同而差異較大，用于推斷PMI的可行性較低。

本研究直接選用人尸體硬腦膜標(biāo)本，避免了動(dòng)物標(biāo)本與人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)換算問題。FAM等[14]研究了20例成人顱底硬腦膜發(fā)現(xiàn)，厚度與硬腦膜年齡呈負(fù)相關(guān)，與體質(zhì)量、身高、體重指數(shù)等無相關(guān)性。同樣，ZWIRNER等[15]對(duì)73例2～94歲死者硬腦膜拉伸試驗(yàn)證實(shí)了上述結(jié)論。因此，本研究在選取樣本時(shí)排除了青少年硬腦膜發(fā)育不完全和老年人硬腦膜脆性增加的樣本，通過只選用男性硬腦膜樣本，排除了年齡因素對(duì)硬腦膜厚度的影響，也排除了課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的男性與女性硬腦膜生物力學(xué)參數(shù)存在差異的問題，盡可能地保證硬腦膜樣本的可比性以及研究結(jié)論的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

本研究也存在一些缺陷：（1）硬腦膜樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)雖然設(shè)定為人死亡距尸體檢驗(yàn)時(shí)間為4 d內(nèi)，盡可能地減小了實(shí)驗(yàn)誤差，但是各組內(nèi)案例死亡時(shí)間分布有一定差異，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在影響；（2）盡管在硬腦膜的納入標(biāo)準(zhǔn)中排除了開放性顱腦損傷以及自身畸形、破裂、壞死和其他硬腦膜病變，但在缺乏現(xiàn)有文獻(xiàn)資料條件下依然難以排除其他不同死因、疾病對(duì)硬腦膜生物力學(xué)參數(shù)的影響，盡管這方面的影響可能較微小。

綜上所述，人死后6～96h的硬腦膜組織厚度以及極限載荷、彈性模量、斷裂力3種生物力學(xué)參數(shù)可作為PMI推斷的新指標(biāo)。