尼瑪潘多，李婷，胡小松，劉春生*

1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院 西藏自治區(qū)藏藥標(biāo)準(zhǔn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

洪連為藏族習(xí)用藥材，始載于《四部醫(yī)典》。《鮮明注釋》云：“洪連門巴隨處皆有”；《度母本草》云:“洪連門巴產(chǎn)自南方者為上品；下品分雌、雄兩類：能開花者為雄，無花者為雌。”《圖譜》云：“雌洪連生于草坪和海濱，葉厚而具皺紋，下垂；花白色，狀如狼尾巴；根如松雞糞，枝被長毛?！薄端{(lán)琉璃》云：“隨處皆生，分雌雄兩種，雄者花藍(lán)色，狀如松雞糞；根狀如蟲?！薄陡事侗静菝麋R》云：“本品根呈灰色，圓錐形，具須根；葉綠色，厚具皺紋，微粗糙，葉背微灰色，卵形或劍形，邊緣有鋸齒，先端急尖或鈍圓；葉柄紫紅色，細(xì)面長；花紫紅色，果實(shí)小，黃紫色。”各地藏醫(yī)多用玄參科的兔耳草、短管兔耳草、全緣兔耳草等植物為洪連門巴，其中，短管兔耳草的形態(tài)特征與上述文獻(xiàn)記載更相近，故為兔耳草的正品[1]。具有清熱解毒、行血調(diào)經(jīng)的作用，在傳統(tǒng)藏醫(yī)中用于治療全身發(fā)熱、腎炎、肺病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、月經(jīng)不調(diào)、綜合物中毒及“心熱”等癥[2]。洪連在臨床上的應(yīng)用較為廣泛，是不少藏成藥的主要組成，如二十味沉香丸、二十五味大湯丸、二十六味通經(jīng)丸、八味沉香利尿丸、二十五味獐芽菜丸等。

2015年版《中華人民共和國藥典》收載的洪連為玄參科短筒兔耳草LagotisbrevitbaMaxim.的干燥全草，1995年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥第一冊(cè)收載玄參科短管兔耳草LagotisbrevitubaMaxim或全緣兔耳草LagotisintegraW.W.Smith的干燥全草，《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1996年版收載革葉兔耳草LagotisalutaceaW. W. Smith.全緣兔耳草LagotisintegraW.W.Smith的干燥全草。

但各地藏區(qū)(西藏、四川、青海、云南、甘肅)除使用上述標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的品種外也有使用其他種的兔耳草。鑒于洪連藥材來源復(fù)雜，品種繁多，極易造成藥材混亂，加之兔耳草屬的植物形態(tài)相似，不能準(zhǔn)確區(qū)分。因此，對(duì)兔耳草屬藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定有著非常重要的意義。

目前對(duì)兔耳草的研究多集中在對(duì)短筒兔耳草的研究，且對(duì)其化學(xué)成分[3-7]研究較多，未見其有采用DNA條形碼對(duì)其鑒定的報(bào)道。近年來，DNA條形碼越來越受到關(guān)注。與傳統(tǒng)鑒定方法相比，DNA條形碼技術(shù)以物種的遺傳信息為鑒定依據(jù)，不受植物生長環(huán)境、發(fā)育階段、樣品形態(tài)和組織部位的限制，具有通用性、客觀性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn)[8]。因此DNA條形碼已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥材鑒定的各個(gè)領(lǐng)域，如植物藥、動(dòng)物藥等。

本研究收集了12批來源于各藏區(qū)的洪連藥材，采用ITS及其葉綠體序列對(duì)其進(jìn)行DNA鑒定，旨在對(duì)洪連進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為進(jìn)一步藏藥資源的開發(fā)與合理利用提供支持。

1 材料

1.1 儀器

BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR儀(德國Biomerta公司)，Bio-Rad 型電泳儀，(北京六一儀器廠)，JY-SPDT型水平電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，BG-gdsAUTD520凝膠成像分析系統(tǒng)(南京華奧儀器有限公司)，MM400冷凍混合球磨儀(德國RETSCH公司)。

1.2 試藥

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(TIANGEN)，2×Taqplus per mastermix(含染料)(北京博邁德發(fā)展有限公司)；樣品收集于各藏區(qū)，具體樣品信息見表1。其中11、12號(hào)樣品由四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院黎躍成老師提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為玄參科兔耳草屬植物。

表1 12份洪連樣品信息

2 方法

2.1 DNA提取

取適量藥材用75%乙醇進(jìn)行表面擦拭，加入液氮，用球磨儀迅速將其研成粉末，采用光譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，具體操作見說明書。提取的樣品DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴(kuò)增

采用30 μL反應(yīng)體系，樣品總DNA 2 μL，正反向引物(ITS引物：F-5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，R-5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；psbA-trnH引物：F-5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′R-5′-CGCGCA-TGGTGGATTCACAATCC-3′；引物各1 μL，2×Mix聚合酶15 μL，ddH2O補(bǔ)足。

PCR反應(yīng)程序：ITS序列：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，至72 ℃ 5 min；psbA序列：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，至72 ℃ 7 min。

2.3 測(cè)序分析

將所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測(cè)于500～750 bp可見單一明亮的條帶。剩余PCR產(chǎn)物經(jīng)北京小師弟商貿(mào)有限公司進(jìn)行一代測(cè)序分析。

2.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ContigExpress進(jìn)行正反拼接，DNAMAN拼接及序列比對(duì)，采用BLAST方法對(duì)獲得的DNA序列在GenBank-NCBI中進(jìn)行相似性同源查詢，采用MEGA5.0對(duì)得到的序列進(jìn)行比對(duì)，分析種內(nèi)、種間的遺傳變異，計(jì)算Kimura2-parameter(K2-P)遺傳距離，構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。

3 結(jié)果

3.1 ITS序列數(shù)據(jù)分析結(jié)果

經(jīng)DNAMAN多序列比對(duì)，序列總長552 bp，各序列相似度達(dá)到97.43%，存在34個(gè)變異位點(diǎn)，見表2。從表中可得出在107 bp時(shí)短管兔耳草無堿基，全緣兔耳草為堿基T，紫葉兔耳草為堿基A，故能將三者進(jìn)行區(qū)分。

根據(jù)其遺傳距離構(gòu)建N-J樹，由圖1可知，1、2、5、9、10共5個(gè)樣品與下載序列短筒兔耳草聚為1支，3、4、7、8、11、12共6個(gè)樣與全緣兔耳草聚為1支，6號(hào)樣與紫葉兔耳草聚為1支。

圖1 洪連樣品ITS N-J樹

3.2 psbA-trnH序列數(shù)據(jù)分析結(jié)果

序列長度約為250 bp，存在12個(gè)變異位點(diǎn)，見表3。在136 bp處，全緣兔耳草為堿基T，紫葉兔耳草為堿基A，短筒兔耳草無堿基，因此能將3個(gè)種很好地區(qū)分。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建N-J樹。由圖3可知，與ITS結(jié)果鑒定結(jié)果相同，1、2、5、9、10共5個(gè)樣品與下載序列短筒兔耳草聚為1支，3、4、7、8、11、12共6個(gè)樣與全緣兔耳草聚為1支，6號(hào)樣與紫葉兔耳草聚為1支。

表2 ITS序列變異位點(diǎn)

注：A .腺嘌呤；T.胸腺嘧啶；C.胞嘧啶；*表示在此處未有堿基。

表3 psbA-trnH序列變異位點(diǎn)

注：A .腺嘌呤；T.胸腺嘧啶；C.胞嘧啶；G.鳥嘌呤。

圖2 洪連樣品psbA-trnHN-J樹

4 討論

準(zhǔn)確的基原鑒定是保障藥材質(zhì)量的根本，因各種原因，民族藥材基礎(chǔ)研究薄弱，基礎(chǔ)工作不足，質(zhì)量控制及監(jiān)管整體水平較低，存在的主要問題是實(shí)際使用的藥材與標(biāo)準(zhǔn)不相符，標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行上存在一定問題[9-10]，目前洪連藥材的臨床用藥與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)存在很大差距，市售藥材的來源較多，藥材在流通中以同屬多種植物作為替代品的現(xiàn)象很常見[11]。因此對(duì)洪連藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別具有非常重要的意義。

本研究采用ITS及psbA-trnH序列對(duì)12批兔耳草屬的藥材進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示，12批的兔耳草來源于3個(gè)種，分別是短管兔耳草、全緣兔耳草與紫葉兔耳草。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建N-J樹3種兔耳草明顯聚為3支，表明DNA條形碼能準(zhǔn)確區(qū)分兔耳草屬的各個(gè)種，并且鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒別結(jié)果相吻合。但鑒于本研究所選取樣本有限，想要實(shí)現(xiàn)快速精準(zhǔn)鑒別，還需要對(duì)更多樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以便積累更多的數(shù)據(jù)。

本研究以藏藥洪連的精準(zhǔn)鑒別為切入點(diǎn)，解決了洪連藥材受樣品形態(tài)、植物生長期、有花無花以及人為主觀因素等限制的問題[12]，為藏藥的準(zhǔn)確鑒別提供了可靠的方法，為藏藥資源進(jìn)一步的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為藏藥的質(zhì)量與臨床安全用藥提供了參考。