魯笑欽，王志紅，付美洲，王 琪，王利君，李元昆

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫(yī)院教育培訓(xùn)部，河南 鄭州 450003)

卵巢癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居第2位，但病死率居首位[1-2]。手術(shù)聯(lián)合化療是卵巢癌患者的主要治療方式，化療耐藥是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的重要因素。順鉑(DDP)在卵巢癌化療方案中極其重要，引起卵巢癌DDP耐藥的原因尚未完全明確。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)通過作為內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)在卵巢癌DDP耐藥中起重要作用。本研究將對lncRNA LOC554202作為ceRNA調(diào)控微小RNA(micro RNA,miR)-98-5p在卵巢癌DDP耐藥中的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、人胚胎腎細(xì)胞系293T(美國ATCC細(xì)胞庫)，注射用DDP(山東齊魯制藥有限公司)，RNA提取Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 1熒光染料試劑盒(日本TaKaRa 公司)，雙熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)，引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，慢病毒包裝試劑盒、LipofectamineTM 3000試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn) 利用在線靶基因預(yù)測工具TargetScan (http://www.targetscan.org/)預(yù)測LOC554202與miR-98-5p存在的結(jié)合位點(diǎn)。利用雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系。LOC554202序列片段(LOC554202-WT、LOC554202-MUT)構(gòu)建熒光素酶報告基因載體pGL4.17。采用lipofectamineTM 3000 將LOC554202-WT或LOC554202-MUT與miR-98-5p-NC或miR-98-5p mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，按雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)試劑盒說明書操作，檢測熒光素酶的熒光活性。

1.2.2 過表達(dá)和敲降LOC554202 利用對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞株和DDP耐藥的A2780(A2780/DDP)細(xì)胞株，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，其余分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOC554202，定量PCR(quantitative PCR，qPCR)檢測細(xì)胞中miR-98-5p的表達(dá)。利用對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，其余分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-LOC554202，qPCR檢測細(xì)胞中miR-98-5p的表達(dá)。

1.2.3 qPCR實(shí)驗(yàn) Trizol抽提總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)：20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：42 ℃，1 h；95 ℃，滅活10 min；冰浴5 min；cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù)從GenBank中查得的基因序列用Primer Design 軟件設(shè)計引物序列如下：LOC554202，F(xiàn)：5’-TCTCTGGTGCTTCCCTCCTT-3’，R：5’-GATCTAAGCTTGAGCCCCCA-3’；miR-98-5p，F(xiàn):5’-CACCGCAGAAGCGGCACTTTATAAGCGAACT-3’，R:5’-TTATAAAGTGCCGCTTCTGCTTATAAGTTCGC-3’; U6，F(xiàn):5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R:5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’；β-actin，F(xiàn)：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，R：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。擴(kuò)增條件：25 μL反應(yīng)體系，94 ℃，2 min，預(yù)變性；94 ℃，30 s，變性；58 ℃，30 s，復(fù)性；72 ℃，40 s，延伸；共進(jìn)行40個循環(huán)。設(shè)定每個循環(huán)退火期結(jié)束后程序自動記錄該循環(huán)的熒光值。qPCR實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，96孔板中接種細(xì)胞后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中。每孔加入10 μL CCK8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的光密度值(OD450)。CCK-8實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LOC554202和miR-98-5p的靶向關(guān)系生物信息學(xué)預(yù)測LOC554202和miR-98-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。LOC554202-wt +miR-NC mimic組、LOC554202-WT +miR-98-5p mimic組、LOC554202-MUT +miR-NC mimic組、LOC554202-MUT +miR-98-5p mimic組熒光活素酶活性值分別為2.608±0.287、1.884±0.067、3.152±0.260、3.051±0.166，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.365，P<0.001)。兩兩比較示，LOC554202-WT +miR-nc mimic組和LOC554202-WT +miR-98-5p mimic組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示過表達(dá)miR-98-5p后，LOC554202熒光素酶活性顯著下調(diào)；LOC554202突變后熒光素酶活性下調(diào)作用消失，證實(shí)了miR-98-5p與LOC554202存在相互作用。

圖1 生物信息學(xué)分析預(yù)測 LOC554202和miR-98-5p靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.2 LOC554202和miR-98-5p在A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株中的表達(dá)LOC554202在A2780/DDP細(xì)胞株中的相對表達(dá)量為0.509±0.032，低于A2780細(xì)胞株的1.001±0.054，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.505，P<0.001)。miR-98-5p在A2780/DDP細(xì)胞株中相對表達(dá)量為2.184±0.076，高于A2780細(xì)胞株的1.001±0.048，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.720，P<0.001)。見圖2、3。

圖2 LOC554202在不同細(xì)胞株中的表達(dá)

A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株比較，t=13.505，P<0.001

圖3 miR-98-5p在不同細(xì)胞株中的表達(dá)

A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株比較，t=22.720，P<0.001

2.3 過表達(dá)或敲降LOC554202對A2780細(xì)胞株miR-98-5p表達(dá)的影響pcDNA3.1-LOC554202組A2780細(xì)胞株LOC554202相對表達(dá)量為1.902±0.060，高于pcDNA3.1組的1.001±0.051，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.874，P<0.001)；pcDNA3.1-LOC554202組A2780細(xì)胞株miR-98-5p相對表達(dá)量為0.635±0.033，低于pcDNA3.1組的1.001±0.064，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.863，P=0.001)；提示LOC554202過表達(dá)后，A2780細(xì)胞株中LOC554202相對表達(dá)量顯著上調(diào)，而miR-98-5p相對表達(dá)量顯著下調(diào)。siRNA-LOC554202組A2780細(xì)胞株LOC554202相對表達(dá)量為0.563±0.057，低于siRNA-NC組的1.000±0.021，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.516，P<0.001)；siRNA-LOC554202組A2780細(xì)胞株miR-98-5p相對表達(dá)量為1.472±0.088，高于siRNA-NC組的1.001±0.042，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.834，P=0.001)；提示LOC554202敲降后，A2780細(xì)胞株中LOC554202相對表達(dá)量顯著下調(diào)，miR-98-5p相對表達(dá)量顯著上調(diào)。見圖4、5。

圖4 過表達(dá)或敲降LOC554202對 A2780細(xì)胞株中LOC554202表達(dá)的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=12.516，P<0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=8.863，P=0.001

2.4 過表達(dá)或敲降LOC554202對A2780/DDP細(xì)胞株miR-98-5表達(dá)的影響pcDNA3.1-LOC554202組A2780/DDP細(xì)胞株LOC554202相對表達(dá)量為2.411±0.193，高于pcDNA3.1組的1.001±0.064，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.016，P<0.001)；pcDNA3.1-LOC554202組A2780/DDP細(xì)胞株miR-98-5p相對表達(dá)量為0.620±0.058，低于pcDNA3.1組的1.001±0.049，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.683，P=0.001)；提示LOC554202過表達(dá)后，A2780/DDP細(xì)胞株中LOC554202相對表達(dá)量顯著上調(diào)，而miR-98-5p相對表達(dá)量顯著下調(diào)。siRNA-LOC554202組A2780/DDP細(xì)胞株LOC554202相對表達(dá)量為0.432±0.012，低于siRNA-NC組的1.000±0.035，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.545，P<0.001)；siRNA-LOC554202組A2780/DDP細(xì)胞株miR-98-5p相對表達(dá)量為1.499±0.057，高于siRNA-NC組的1.000±0.036，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.723，P<0.001)；提示LOC554202敲降后，A2780/DDP細(xì)胞株中LOC554202相對表達(dá)量顯著下調(diào)，miR-98-5p相對表達(dá)量顯著上調(diào)。見圖6、7。

圖5 過表達(dá)或敲降LOC554202對 A2780細(xì)胞株中miR-98-5p表達(dá)的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=19.874，P<0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=8.834，P=0.001

2.5 LOC554202對A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株增殖的影響對于A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株，LOC554202過表達(dá)均可顯著抑制細(xì)胞增殖(F=112.060，P<0.001；F=74.988，P<0.001)，而LOC554202敲降均可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(F=39.842，P<0.001；F=34.087，P<0.001)。見圖8。

2.6 LOC554202對A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株IC50的影響對于A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株，LOC554202過表達(dá)均可顯著降低細(xì)胞的IC50，而LOC554202敲降均可顯著提升細(xì)胞的IC50。見圖9。

3 討論

卵巢癌惡性程度高，起病隱匿，大多數(shù)被發(fā)現(xiàn)時已處于臨床Ⅲ～Ⅳ期。卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)和鉑類聯(lián)合紫杉醇化療是晚期卵巢癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但超過25%的患者會發(fā)生對鉑類的耐藥，并且部分耐藥患者對后續(xù)鉑類化療方案的反應(yīng)性不足30%[2-3]。

圖6 過表達(dá)或敲降LOC554202對 A2780/DDP細(xì)胞株中LOC554202表達(dá)的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=12.016，P<0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=26.545，P<0.001

圖7 過表達(dá)或敲降LOC554202對 A2780/DDP細(xì)胞株中miR-98-5p相對表達(dá)量的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=8.683，P=0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=12.723，P<0.001

編碼lncRNA LOC554202的基因位于9p21.3。在不同腫瘤組織中，LOC554202可表現(xiàn)為癌基因或抑癌基因的作用[4]。LOC554202在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)，可能通過下調(diào)p21和E-cadherin的表達(dá)水平促進(jìn)胃癌增殖和遷移[5]。敲降LOC554202會降低乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并在體外抑制遷移或侵襲，在體內(nèi)抑制腫瘤發(fā)生[6]。高水平的LOC554202預(yù)示宮頸癌預(yù)后不良[7]。LOC554202在直腸癌中低表達(dá)，并與病理分期和腫瘤大小密切相關(guān)；其過表達(dá)在體外降低細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)阻礙了腫瘤的發(fā)生[8]。LOC554202通過上調(diào)miR-31表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的獲得性吉非替尼耐藥[4]。過表達(dá)的LOC554202提示奧沙利鉑治療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后良好[9]。

圖8 LOC554202對A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株增殖的影響

圖9 LOC554202對A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株IC50的影響

miR-98-5p屬于let-7家族成員。miR-98-5p在乳腺癌中起抑癌作用[10]。LncRNA SNHG4通過抑制miR-98-5p的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。HEIH可以通過miR-98-5p/HECTD4軸促進(jìn)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展[12]。miR-98-5p可通過天冬酰胺連接的糖基化3對非小細(xì)胞肺癌起到負(fù)調(diào)控的作用[13]。miR-98-5p的過表達(dá)與卵巢上皮性癌患者的DDP耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)，其過表達(dá)顯著增強(qiáng)卵巢上皮性癌對DDP治療的耐藥性[14]。攜帶成纖維細(xì)胞驅(qū)動的外泌體攜帶過表達(dá)的miR-98-5p，可通過下調(diào)p21細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4抑制劑1A促進(jìn)卵巢癌對DDP的耐藥[15]。

本研究結(jié)果顯示:相較于A2780細(xì)胞株，A2780/DDP細(xì)胞株中LOC554202呈低表達(dá)，miR-98-5p呈過表達(dá)。說明LOC554202和miR-98-5p可能與卵巢癌DDP耐藥相關(guān)。隨后進(jìn)行的生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)證實(shí)LOC554202是miR-98-5p的靶標(biāo)。在A2780細(xì)胞株和A2780/DDP細(xì)胞株中，LOC554202的過表達(dá)和敲降均會導(dǎo)致miR-98-5p相對表達(dá)量的顯著下調(diào)和上調(diào)，并可影響細(xì)胞的增殖能力和耐藥。這說明無論在A2780細(xì)胞株中，還是在A2780/DDP細(xì)胞株中，LOC554202均可通過ceRNA調(diào)控miR-98-5p的表達(dá)，且LOC554202均可顯著影響細(xì)胞的增殖和耐藥。

綜上所述，lncRNA LOC554202和miR-98-5p可能與卵巢癌DDP耐藥相關(guān)，LOC554202可通過ceRNA調(diào)控miR-98-5p的表達(dá)，調(diào)控卵巢癌DDP化療的耐藥。