樊大貝，張好好

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450052)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，占總體惡性腫瘤病例數(shù)量的1%～2%。隨著人類生活水平明顯提高，世界范圍內(nèi)甲狀腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1]。其中，甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌的一個(gè)常見類型，大約占總甲狀腺癌病例數(shù)量的80%[2]。這類疾病具有發(fā)病隱匿性的特點(diǎn)，往往因早期癥狀輕，病情穩(wěn)定，不易引起重視，以至于后期延誤治療，造成患者及其家屬生活、醫(yī)療、工作成本負(fù)擔(dān)加劇。因此，需要對(duì)患者盡早的診斷和治療。臨床上通常采用細(xì)針穿刺活檢方式進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析，以判斷甲狀腺乳頭狀癌的診斷，但是這種方法也存在一定的局限性，因此，需要用其他更先進(jìn)的方式進(jìn)行甲狀腺乳頭狀癌的診斷。

長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid, lncRNA)是一類大于200個(gè)核苷酸的RNA，本身無蛋白質(zhì)編碼功能，但對(duì)于調(diào)節(jié)基因功能和細(xì)胞增殖具有十分重要的作用[3]。lncRNA可以調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄活性、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)穩(wěn)定性、mRNA轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA翻譯等各類生物過程[4]。在惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估中，lncRNA可以作為一類新型的生物標(biāo)志物應(yīng)用。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS8-AS1可以作為甲狀腺乳頭狀癌診斷的一種重要生物標(biāo)志物，但是在臨床上并沒有得到有效證實(shí)。鑒于此，本研究通過對(duì)81例甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行病理學(xué)結(jié)合lncRNA GAS8-AS1表達(dá)分析，探討lncRNA GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌鑒別診斷及預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值，為甲狀腺乳頭狀癌的快速有效診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象納入2013年1月至2018年2月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的經(jīng)臨床病理學(xué)確診的甲狀腺乳頭狀癌患者81例作為試驗(yàn)組。此外，選取2015年12月至2018年4月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的經(jīng)臨床病理學(xué)確診的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者66例作為對(duì)照組。2組患者的年齡、性別等一般臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品收集 甲狀腺乳頭狀癌患者的血液樣品在患者術(shù)前禁食條件下和術(shù)后1 a禁食條件下進(jìn)行收集，每例患者抽取約10 mL靜脈血至含有乙二胺四乙酸的采集管中。血液收集后1 h內(nèi)在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中，樣品經(jīng)過分光光度計(jì)檢測(cè)合格后加入適量Trizol(美國Invitrogen公司)后儲(chǔ)存在-80 ℃條件下備用。對(duì)照組的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者同樣按照上述方法采集血液。甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤組織通過手術(shù)取出后置于滅菌后的離心管中儲(chǔ)存在-80 ℃條件下備用。

1.2.2 樣品RNA提取 液氮條件下在研缽中研磨腫瘤組織充分后加入適量Trizol，繼續(xù)研磨至液體狀態(tài)后轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管中，渦旋30 s后，靜置5 min，在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min后取上清液1 mL至滅菌的離心管中。向管中加入200 μL的氯仿，渦旋30 s后，靜置3 min，在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min后取上層水相轉(zhuǎn)至滅菌的離心管中。向管中加入等體積的異丙醇，渦旋15 s后，靜置10 min，在4 ℃、12 000 g條件下離心10 min后除去上清液，隨后用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌RNA沉淀，4 ℃、7 500 g條件下離心5 min后風(fēng)干液體殘留，加入適量(30 μL)的焦碳酸二乙酯處理水。通過NanoDrop分光光度計(jì)和生物分析儀評(píng)估RNA濃度和完整性。血液樣品解凍后按照上述步驟提取RNA，并檢測(cè)RNA濃度和評(píng)估RNA完整性。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA表達(dá)水平 將提取后的RNA采用日本Takara公司的PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)脫氧核糖核酸。lncRNA GAS8-AS1的相對(duì)表達(dá)分析通過熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcript polymerase chain reaction，qRT-PCR)實(shí)現(xiàn)，按照日本Takara公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進(jìn)行操作,并使用Bio-rad CFX96 qPCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。使用2-ΔΔCT方法分析lncRNA GAS8-AS1相對(duì)表達(dá)水平，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。此外，qRT-PCR中涉及的引物由生工生物進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成，引物序列如下：lncRNA GAS8-AS1-F: CAACGAGCAAACAAGAAGGAG; lncRNA GAS8-AS1-R: TGAGCCAAACAGACCAGTCA;內(nèi)參基因β-actin-F: GTGGCCGAGGACTTTGATTG; 內(nèi)參基因β-actin-R: CCTGTAACAACGCATCTCATATT。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌患者的臨床病理資料81例患者中，男27例，女54例，年齡21～68歲。所有患者均采用細(xì)針穿刺活檢確診為甲狀腺乳頭狀癌，其中58例患者腫瘤位于甲狀腺腺體的右葉，6例患者腫瘤位于甲狀腺的雙側(cè)腺葉，17例患者腫瘤位于甲狀腺腺體的左葉。81例患者在術(shù)前進(jìn)行甲狀腺功能檢測(cè)顯示功能均正常。81例患者在術(shù)前進(jìn)行B超檢查，結(jié)果顯示，75例患者甲狀腺結(jié)節(jié)數(shù)目為1個(gè)，6例患者甲狀腺結(jié)節(jié)數(shù)目為2個(gè)(腫瘤分別位于甲狀腺的雙側(cè)腺葉)。81例患者的治療方式均為單純手術(shù)切除。術(shù)后隨訪調(diào)查顯示患者恢復(fù)良好。

2.2 lncRNA GAS8-AS1在試驗(yàn)組和對(duì)照組血液及試驗(yàn)組腫瘤組織中的表達(dá)水平術(shù)前，試驗(yàn)組患者血液中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。術(shù)前，試驗(yàn)組患者腫瘤組織中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1相對(duì)表達(dá)量與其血液中的相對(duì)表達(dá)量相近(P>0.05)，且較對(duì)照組血液中的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。術(shù)后1 a，試驗(yàn)組患者血液中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1的相對(duì)表達(dá)量較術(shù)前明顯升高(P<0.05)，且與對(duì)照組血液中的相對(duì)表達(dá)量相近(P>0.05)。見圖1。

圖1 lncRNA GAS8-AS1在試驗(yàn)組和對(duì)照組血液及試驗(yàn)組腫瘤組織中的表達(dá)水平

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是一種常見的甲狀腺疾病，其發(fā)病年齡范圍廣[6]。盡管絕大多數(shù)患者在手術(shù)切除治療后預(yù)后良好，但是仍然有極少數(shù)會(huì)復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)診斷方法是通過超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢，對(duì)于甲狀腺結(jié)節(jié)較大的患者而言，這種方式具有很高的準(zhǔn)確性，但是對(duì)于甲狀腺結(jié)節(jié)<5 mm的患者其準(zhǔn)確性大幅下降，因此，如何快速高效診斷甲狀腺乳頭狀癌具有重要的臨床意義[7-8]。lncRNA在腫瘤生物學(xué)中具有十分關(guān)鍵的作用，并且在腫瘤診斷和預(yù)后方面可以作為一類新型的生物標(biāo)志物。甲狀腺乳頭狀癌中已經(jīng)鑒定出多種表達(dá)異常的lncRNA，其可能影響和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。Lan等[9]鑒定出lncRNA NONHSAT037832在甲狀腺乳頭狀癌中的功能和臨床意義。Qin等[10]觀察MIR22HG在甲狀腺癌中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明MIR22HG可以作為甲狀腺癌的新型生物標(biāo)志物。

LncRNA GAS8-AS1是近期鑒定出的一種lncRNA，在甲狀腺乳頭狀癌患者體內(nèi)表達(dá)異常。相關(guān)證據(jù)顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1表達(dá)水平相對(duì)于正常組織而言顯著降低[11]。此外，患者血液中的lncRNA GAS8-AS1表達(dá)水平也明顯處于抑制狀態(tài)[5]。這提示lncRNA GAS8-AS1可以作為一種新型的生物標(biāo)志物用于臨床上甲狀腺乳頭狀癌的診斷。本研究根據(jù)臨床病例證實(shí)，甲狀腺乳頭狀癌患者的血液和腫瘤組織中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1明顯低于對(duì)照組，而且，術(shù)后患者血液中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1明顯回升，這進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA GAS8-AS1對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)具有重要作用。當(dāng)然，lncRNA GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展、遷移等生物過程中的具體作用機(jī)制需要后續(xù)更多的實(shí)驗(yàn)來證明。

綜上所述，檢測(cè)lncRNA GAS8-AS1在甲狀腺乳頭狀癌術(shù)前和術(shù)后的表達(dá)水平有助于進(jìn)一步推斷l(xiāng)ncRNA GAS8-AS1作為生物標(biāo)志物用于鑒定甲狀腺乳頭狀癌的可行性，為lncRNA用于甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷和術(shù)后監(jiān)測(cè)提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。