李 娜 武恩斯 聞小霞 趙新宇 李巖杰 曹修才

（聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東聊城252000）

山東省聊城市栽培平菇已有30多年的歷史，且主要集中在東昌府區(qū)、臨清、冠縣等。2018年全市食用菌總投料達(dá)68.95萬(wàn)t，栽培面積1 303 hm2，總產(chǎn)量50.26萬(wàn)t，其中平菇產(chǎn)量37.55萬(wàn)t，位居第一。近年來(lái)平菇球形菇成為當(dāng)?shù)仄焦缴a(chǎn)上主要病害，經(jīng)調(diào)查，除聊城東昌府區(qū)多年使用的老菇棚外，在東昌府區(qū)、臨清市等新建菇棚內(nèi)，不論是冬暖大棚層架式栽培還是半地下墻式栽培模式，平菇球形菇均普遍發(fā)生，給菇農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

王慶武等認(rèn)為栽培環(huán)境條件、管理措施和農(nóng)藥藥害是產(chǎn)生球形菇的主要原因[1]。師迎春等認(rèn)為平菇被平菇球形病毒（oyster mushroom spherical virus，OMSV）侵染后，出現(xiàn)菌絲退化，菌柄短粗等癥狀，造成平菇球形菇發(fā)生[3]。而平菇球形菇病癥早期不易發(fā)現(xiàn)，出菇才顯癥，不易防控。

為了解聊城市球形菇的發(fā)生情況，查找球形菇發(fā)生的原因，筆者實(shí)地調(diào)查采樣，并對(duì)樣本進(jìn)行組織分離培養(yǎng)，同時(shí)利用特異性引物對(duì)樣本平菇球形病毒（oyster mushroom spherical virus，OMSV）進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年12月—2018年3月在山東省聊城東昌府區(qū)、臨清等區(qū)（縣）平菇栽培地采集表現(xiàn)畸形、子實(shí)體小、呈喇叭花狀、花束狀叢生的平菇樣品11份，樣本編號(hào)整理后存放在4℃冰箱內(nèi)，及時(shí)進(jìn)行組織分離。

1.2 組織分離

將樣品放入超凈工作臺(tái)，在菌蓋與菌柄交界處切取小塊菌肉，迅速接入PDA平板中部，25℃培養(yǎng)，3～5 d后即可看到組織塊周圍長(zhǎng)出白色稀疏纖細(xì)的菌絲。

1.3 轉(zhuǎn)接平板培養(yǎng)菌落的觀察和測(cè)定

取1.2菌絲瓊脂塊（0.7 cm×0.7 cm）轉(zhuǎn)接在無(wú)冷凝水的PDA平板上，25℃培養(yǎng)。每個(gè)樣本3次重復(fù)用。“十”字交叉法，測(cè)量培養(yǎng)120 h后的菌落直徑，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

菌絲平均生長(zhǎng)速度（cm/d）=菌落半徑（cm）/菌絲生長(zhǎng)天數(shù)（d）。

1.4 RT-PCR檢測(cè)平菇球形病毒

取1.3培養(yǎng)菌絲接入液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)7 d后，3 000 r/min離心收集菌絲體，Trizol法或植物RNA提取試劑盒提取菌絲總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。用平菇球形病毒（OMSV）特異引物[3]（OMSV4910F 5'-TACCCCCCCAGGATCTCAAGCTTCT-3'和OMSV5556R 5'-TGAAAGCGCGTCCAT-CAGAACCATTC-3'），擴(kuò)增基因部分片段。PCR 反應(yīng)體系（25μL）：cDNA 3μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5μL，上下游引物各0.5μL，10×反應(yīng)緩沖液2.5μL，Taq DNA聚合酶0.25μL（5U/μL），ddH2O 17.75μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫[3]。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后觀察到明亮的條帶后，送華大基因測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集樣品

采集的樣本見圖1。

2017年12月—2018年3月在聊城平菇主要栽培區(qū)東昌府區(qū)、臨清市平菇棚區(qū)采集表現(xiàn)畸形、子實(shí)體小、呈喇叭花狀11份平菇樣本，涉及六個(gè)品種，分別為抗2、抗3、8129、8105、969、德豐5號(hào)；采集地分布在臨清煙店、尚店，東昌府區(qū)閆寺、堂邑、米爐等地。

2.2 組織分離菌絲培養(yǎng)性狀

樣品組織分離后，取0.7 cm×0.7 cm菌塊轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。5 d后觀察，11份樣品中，8129平菇菌株（3號(hào)）菌絲幾乎未生長(zhǎng)，其余樣品（除4號(hào)抗2外）菌落生長(zhǎng)邊緣均不規(guī)則，整齊度差，菌絲生長(zhǎng)緩慢；除3號(hào)外剩余10個(gè)樣品菌落長(zhǎng)滿平板（直徑9 cm）的時(shí)間在7.8～15.1 d，而且多數(shù)菌絲生長(zhǎng)15 d后產(chǎn)生橘紅色素（表1，圖2）。

圖1 聊城市采集部分平菇球形菇樣本

圖2 樣本培養(yǎng)5 d菌落（1-11號(hào)）及部分樣本（A-D）培養(yǎng)15 d狀態(tài)（產(chǎn)生橘紅色素）

表1 樣本組織分離培養(yǎng)菌絲觀察測(cè)定結(jié)果

2.3 RT-PCR檢測(cè)平菇球形病毒

利用特異引物OMSV4910F/OMSV5556R進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)10個(gè)球形菇培養(yǎng)的菌絲體（3號(hào)菌絲未生長(zhǎng)，未進(jìn)行檢測(cè)），均得到約700 bp的基因片段。通過測(cè)序和序列比對(duì)分析表明，擴(kuò)增得到的基因序列為OMSV標(biāo)準(zhǔn)序列（ID：NC_004560.1）的部分基因核酸序列，經(jīng)BLAST比對(duì)，相似度在90.8%～91.2%。序列分析結(jié)果表明，此次采集的平菇樣品均被平菇球形病毒（OMSV）感染。

圖2 聊城市平菇球形菇樣本中球形病毒（OMSV）檢測(cè)電泳圖

3 小結(jié)與討論

平菇球形菇已成為制約聊城市平菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。對(duì)聊城東昌府區(qū)、臨清市等地平菇球形樣品的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，采集到的病樣均能檢測(cè)到平菇球形病毒。

平菇感染平菇球形病毒后，前期只是表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)速度減慢，出菇后才表現(xiàn)出菌柄腫脹呈漏斗或喇叭花狀等朵形球狀明顯癥狀，因此難以做到及時(shí)防控，目前尚無(wú)有效的生物或化學(xué)防治手段[3]。

筆者結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，提出如下防控建議供參考：（1）穩(wěn)定可靠的菌種來(lái)源，從源頭上控制菌種質(zhì)量。應(yīng)使用符合GB/T 21125—2007食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范要求[5]選育的品種，且清楚種性，并從具有相應(yīng)技術(shù)資質(zhì)的供種單位引種；菌種運(yùn)輸過程中確保有防曬、防潮、防雨、防凍、防振以及防止雜菌污染的設(shè)施和措施，從源頭確保菌種質(zhì)量。（2）嚴(yán)格篩選優(yōu)質(zhì)母種。母種出現(xiàn)菌絲羸弱、形狀扭曲不規(guī)則、顏色暗黃以及保存時(shí)間超過1個(gè)月應(yīng)全部剔除；嚴(yán)控轉(zhuǎn)管次數(shù)，剔除長(zhǎng)勢(shì)過強(qiáng)及過弱的菌株，保證母種活性及一致性。（3）切斷傳播途徑，降低感染概率。接種操作規(guī)范；菇棚設(shè)置60目防蟲網(wǎng)防蟲；已發(fā)生球形菇的菇棚，空氣中噴霧，阻止帶毒孢子飛揚(yáng)，并在生產(chǎn)結(jié)束后加強(qiáng)菇棚及土壤消毒。

試驗(yàn)中樣本組織分離菌絲長(zhǎng)勢(shì)較差，出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象，特別是8129、德豐5號(hào)兩個(gè)品種。因未調(diào)查菌種來(lái)源，故而無(wú)法得出病毒的發(fā)生是因?yàn)榫N本身帶毒還是因?yàn)榫晖嘶?，抗性降低，后期感染所致。因此有待進(jìn)一步調(diào)查研究。