余美瓊,朱金環(huán) ,楊金杯,陸文敬,陳玲玲

（福建技術(shù)師范學(xué)院海洋與生化工程學(xué)院,福建福清 350300）

無(wú)患子（Sapindus mukorossi Gaertn.）又名油患子、油羅樹(shù)和洗手果,屬于亞熱帶植物,原產(chǎn)我國(guó)長(zhǎng)江流域以南及中南半島、印度和日本.在我國(guó)主要分布在淮河流域以南各省(廣東、福建、浙江、廣西、浙江等)的丘陵山區(qū)[1,2].無(wú)患子提取液在中國(guó)傳統(tǒng)文化中常常被用來(lái)清洗頭發(fā)和身體,《本草綱目》中記載用無(wú)患子浸提液洗發(fā)去頭屑、洗臉增白祛斑.無(wú)患子皂苷是無(wú)患子中重要的活性成分之一,主要存在于果實(shí)部位,是一種天然的非離子型表面活性劑[3],具有良好的起泡和去污性能.無(wú)患子皂苷是很好的農(nóng)藥乳化劑[4].藥理研究表明,無(wú)患子果皮所含皂苷成分具有抗菌作用[5]、抑制乳腺癌作用[6]等多種生物活性.

目前,無(wú)患子總皂苷的提取方法很多,如水溶劑減壓提取[7]、乙醇浸提[8]、丙酮浸提[9]、復(fù)合酶法提取[10]、超聲波提取[11]、大孔樹(shù)脂吸附提取[12]、水提醇沉[13]等等.但現(xiàn)有無(wú)患子總皂苷提取方法普遍存在提取步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)、能耗高、提取率低等問(wèn)題,有待進(jìn)一步研究.筆者在前期分別采用乙醇浸提法、乙醇-超聲提取法提取無(wú)患子總皂苷,在最佳提取條件下,提取率分別為 5.67% 和 7.02% ,提取效果不佳.酶法輔助提取是近年來(lái)用于植物功能性成分提取的一項(xiàng)生物工程技術(shù)[14],是利用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等處理植物原料后,將細(xì)胞壁內(nèi)的蛋白、果膠等酶解掉,使得目標(biāo)物得到純化,具有操作時(shí)間短、成本低、作用條件溫和等優(yōu)點(diǎn).復(fù)合酶集合了纖維素酶和果膠酶,兩種酶共同發(fā)揮作用,破壞植物組織細(xì)胞壁的致密性[15],改變細(xì)胞壁的通透性[16],可以有效降解細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的果膠、纖維素等,利于活性成分溶出,提取效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用纖維素酶、果膠酶[17].考慮到無(wú)患子假種皮細(xì)胞壁組成主要為纖維素和果膠質(zhì),基于酶具有高效性和特異性.本研究采用纖維素酶和果膠酶組成的復(fù)合酶制劑，輔助提取無(wú)患子總皂苷.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑和儀器

無(wú)患子粉末（福建源華林業(yè)生物科技有限公司）；纖維素酶（10萬(wàn)U/g)、果膠酶（5萬(wàn)U/g),均購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品98%（HPLC級(jí),上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；香草醛、高氯酸、冰醋酸、無(wú)水乙醇、甲醇,均為分析純,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

THZ-82A 回旋式恒溫水浴振蕩器（浙江省紹興市蘇珀儀器有限公司）,DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）,UV-1800PC-DS2型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）,抽濾機(jī)（鞏義市予華儀器有限公司）,電子分析天平（精儀達(dá)盛電子公司,日本島津AVY220）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)患子總皂苷的提取方法

將無(wú)患子粉末過(guò)80目篩,在60 ℃烘箱中干燥至恒重,備用.準(zhǔn)確稱取無(wú)患子粉末2.0 g于150 mL具塞錐形瓶中,加入50 mL蒸餾水,室溫下浸泡24 h.在錐形瓶中加入一定質(zhì)量比（具體見(jiàn)結(jié)果與討論部分）的由果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶制劑（總酶用量為6%,以無(wú)患子粉末質(zhì)量為基準(zhǔn)）,調(diào)節(jié)溶液的pH值,將錐形瓶放置于一定溫度（具體見(jiàn)結(jié)果與討論部分）的恒溫水浴振蕩器中酶解一定時(shí)間（具體見(jiàn)結(jié)果與討論部分）.提取液趁熱抽濾,將濾渣放入三口燒瓶中,加入50 mL 70%的乙醇溶液回流提取1 h,抽濾；濾渣重復(fù)提取2次,合并濾液并定容至250 mL的容量瓶,取0.1 mL濾液采用分光光度法測(cè)定無(wú)患子總皂苷含量.每個(gè)提取實(shí)驗(yàn)平行三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值.

1.2.2 無(wú)患子總皂苷含量的測(cè)定

由于目前市面上沒(méi)有純的無(wú)患子皂苷標(biāo)準(zhǔn)品,而無(wú)患子總皂苷主要為齊墩果酸型的三萜皂苷,因此選擇齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,用香草醛-高氯酸比色法進(jìn)行皂苷濃度測(cè)定.在文獻(xiàn)測(cè)試方法[18-21]的基礎(chǔ)上,做了一定的改進(jìn).

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g,加甲醇溶解,定容至100 mL,得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

顯色劑溶液配制 精密稱取香草醛0.50g置于10mL容量瓶中,加入冰醋酸使其溶解,定容并搖勻,制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的香草醛-冰醋酸顯色溶液,顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配.

最大吸收波長(zhǎng)的確定 取標(biāo)準(zhǔn)溶液和無(wú)患子皂苷提取液各 0.20 mL于具塞試管中,置于80 ℃烘箱中烘干,準(zhǔn)確加入 5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL,高氯酸1.60 mL,搖勻,于60℃恒溫水浴中加熱15 min后取出在流水下冷卻至室溫,加冰醋酸定容至10 mL,搖勻,靜置20 min.以蒸餾水為空白對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)在400～700 nm范圍內(nèi)測(cè)兩者最大吸收波長(zhǎng),其最大吸收波長(zhǎng)均為553 nm.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取1.0 mg/mL標(biāo) 準(zhǔn)溶液 0、20.0、40.0、 80.0、120.0、160.0、200.0 、240.0μL于10mL具塞試管中,在80 ℃烘箱中烘干,加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL,高氯酸1.60 mL,搖勻,于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min后取出在流水下冷卻至室溫,加冰醋酸定容至10 mL,搖勻,靜置20 min.以空白溶液為參比,于553 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組的吸光度值.以吸光度(A)為縱坐標(biāo)y,以對(duì)照品溶液溶度（μg/mL）為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為：y=0.0283 x -0.0103, R2= 0.9995.

無(wú)患子總皂苷含量測(cè)定 準(zhǔn)確吸取0.10 mL濾液（樣品）于具塞試管中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法,測(cè)定濾液的濃度,并計(jì)算無(wú)患子總皂苷的提取率.

式中：X,皂苷質(zhì)量濃度（μg/mL）；

V,濾液總體積（mL）；

V',樣品體積（0.10 mL）；

m,無(wú)患子粉末的質(zhì)量2.0 g.

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù),設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）,按1.2.1提取方法,以總皂苷提取率為指標(biāo),來(lái)確定復(fù)合酶法提取無(wú)患子總皂苷的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件.利用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶配比對(duì)無(wú)患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入不同配比的復(fù)合酶制劑（m果膠酶∶ m纖維素酶=0∶1、1∶0、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1 和 5∶1）,調(diào)節(jié)溶液 pH 值為 4.0,在50 ℃下恒溫震蕩90 min.不同復(fù)合酶配比對(duì)無(wú)患子總皂苷的提取率影響見(jiàn)圖1.

圖1 復(fù)合酶配比對(duì)總皂苷提取率的影響

由圖1分析知,只添加單一的纖維素酶(0∶1)或果膠酶(1∶0),總皂苷的提取率較低,添加果膠酶的提取率略高于添加纖維素酶的提取率,復(fù)合酶制劑的提取率高于單一酶的作用,這可能是由于復(fù)合酶制劑間具有協(xié)同作用.無(wú)患子假種皮細(xì)胞壁組成主要為纖維素和果膠質(zhì),纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶促進(jìn)了細(xì)胞壁的分解,加快了皂苷向溶劑的擴(kuò)散傳質(zhì)[16].隨著復(fù)合酶配比的增大,提取率先上升后下降,可能是由于隨著復(fù)合酶配比的增加,果膠酶含量增加,細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解了,有利于總皂苷的提??；但是同時(shí)纖維素酶含量減少了,細(xì)胞壁的通透性下降,又使得總皂苷提取率下降.因此,取最佳復(fù)合酶配比2∶1繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn).

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)無(wú)患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入配比為2∶1的復(fù)合酶制劑,調(diào)節(jié)溶液pH為4.0,分別在50℃下恒溫震蕩30、60、90、120、150 min.不同酶解時(shí)間對(duì)無(wú)患子總皂苷的提取率影響見(jiàn)圖2.

圖2 酶解時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響

由圖 2可知,酶解初期,隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),提取率逐漸增加,在酶解時(shí)間為90 min 時(shí),提取率最高,之后隨著酶解時(shí)間的增加,總皂苷的提取率反而減小.這可能是因?yàn)闀r(shí)間短,酶的活性沒(méi)有被充分利用,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),在一定范圍內(nèi),可促進(jìn)皂苷的溶出[22]；而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致部分酶失去活性,還有部分皂苷發(fā)生水解[9],使得總皂苷提取率降低.

2.1.3 酶解溫度對(duì)無(wú)患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入配比為2∶1的復(fù)合酶制劑,調(diào)節(jié)溶液pH為4.0,分別在30、40、50、60、70 ℃下恒溫震蕩90 min.不同酶解溫度對(duì)無(wú)患子總皂苷的提取率影響見(jiàn)圖3.

由圖3可知,總皂苷提取率隨著酶解溫度的上升先增加后減小.由30 ℃升至60 ℃時(shí),提取率隨酶解溫度增大而增大,說(shuō)明溫度升高有利于提高酶的活性,促進(jìn)酶對(duì)無(wú)患子假種皮細(xì)胞壁中纖維素及果膠質(zhì)等物質(zhì)的分解,同時(shí)溫度升高分子運(yùn)動(dòng)速度加快,能夠促使皂苷快速溶解出來(lái)[10,22].但是當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí),總皂苷的提取率反而下降,這可能是由于超過(guò)一定溫度,導(dǎo)致酶活性降低或部分失活[22].

圖3 酶解溫度對(duì)總皂苷提取率的影響

2.1.4 pH值對(duì)無(wú)患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入配比為2∶1的復(fù)合酶制劑,分別調(diào)節(jié)溶液pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,在60 ℃下恒溫震蕩90 min.不同pH值對(duì)無(wú)患子總皂苷的提取率影響見(jiàn)圖4.

圖4 pH值對(duì)總皂苷提取率的影響

由圖4可知,無(wú)患子總皂苷的提取率隨pH值的升高先增大后減小.這可能是由于pH值不在酶的最適宜pH 范圍內(nèi)時(shí)會(huì)導(dǎo)致酶活性降低[16],從而使得纖維素降解、果膠分解不徹底.因?yàn)椴煌冈诓煌琾H 范圍活性不同[23],纖維素酶在pH為5.0～6.5時(shí)具有最佳活性,而果膠酶在pH 為4.0～4.8時(shí)具有最佳活性.復(fù)合酶最適合的pH值為5.0.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 無(wú)患子總皂苷提取率方差分析表

由表2和表3分析可見(jiàn)：各因素對(duì)無(wú)患子總皂苷提取率的影響順序?yàn)镈＞C＞A＞B,即pH值＞酶解溫度＞復(fù)合酶配比＞酶解時(shí)間.從k值判斷可以得出無(wú)患子皂苷的提取最優(yōu)工藝為A3B3C2D1,即復(fù)合酶配比為3∶1、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度50 ℃、pH值為4.0,也正是正交實(shí)驗(yàn)表中的9號(hào)實(shí)驗(yàn).9號(hào)實(shí)驗(yàn)條件下的3次平行實(shí)驗(yàn),無(wú)患子總皂苷的提取率分別為：19.42%、19.46%、19.45%,平均值為19.44%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0208,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%,說(shuō)這明復(fù)合酶解提取工藝具有良好的穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

采用果膠酶和纖維素酶復(fù)合酶輔助乙醇提取無(wú)患子總皂苷,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),得出復(fù)合酶法輔助提取無(wú)患子總皂苷的最佳條件為：復(fù)合酶配比為3∶1、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度50 ℃、pH值為4.0,在此條件下無(wú)患子總皂苷的提取率為19.44%.與 水溶劑減壓提?。?5.43%）[7]、丙酮浸提（5.72%）[9]、超聲波提?。?.41%）[11]、水提醇沉法（3.66%）[13]、乙醇浸提（14.26%）[24]提取無(wú)患子總皂苷相比,提取率有較大的提高.