王英燕, 陳文娜, 賈存江, 房樹標, 秦斌, 朱正喬

江蘇神華藥業(yè)有限公司, 江蘇 淮安 211600

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，最早由Hartsen于1873年從莓果中分離發(fā)現(xiàn)，為結晶性深紅色色素[1]。番茄紅素在自然界中的西瓜、南瓜、李子、柿子、胡蘿卜等果蔬中都有存在，但天然含量較低，其在成熟的紅色果實中含量較高，其中含量最高的是番茄，僅30～140 mg·kg-1[2-5]。番茄紅素具有很好的抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功能，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領域[6-8]。

目前，番茄紅素的生產(chǎn)方法主要包括天然提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法。天然提取法番茄紅素產(chǎn)量低，成本高且受制于原料來源；化學合成法存在安全隱患；而微生物發(fā)酵法具有工藝簡單、生產(chǎn)效率高、生物活性與天然植物提取物一致等優(yōu)點[9-11]，越來越受到關注。

已知的可用于發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的微生物有經(jīng)基因改造的酵母菌[12]、紅色細菌[13]、革蘭氏陰性非光合菌[14]及三孢布拉氏霉菌。三孢布拉霉是國內外唯一能夠實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)胡蘿卜素的菌株，而番茄紅素是胡蘿卜素發(fā)酵生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)物，因此，三孢布拉霉是番茄紅素發(fā)酵生產(chǎn)的理想菌株[15]。本研究利用液態(tài)深層發(fā)酵技術，采用三孢布拉氏霉菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，優(yōu)化發(fā)酵中間過程參數(shù)，旨在進一步提高番茄紅素的發(fā)酵產(chǎn)量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 三孢布拉氏霉菌正菌(+)和負菌(-)，由本公司菌種保藏中心篩選保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：淀粉6%、葡萄糖1%、黃豆餅粉3%、亞油酸0.001%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.025%、維生素B1 0.001%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉4.5%、葡萄糖1.8%、玉米漿2.5%、黃豆餅粉2.8%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.02%、維生素B1 0.002%。

1.1.3 試劑 番茄紅素標準品購自美國Sigma公司；淀粉、葡萄糖購自南京京潤生物科技有限公司；花生油、菜籽油、玉米油購自山東魯花集團有限公司；黃豆餅粉、大豆油購自阜豐集團有限公司；維生素B1購自蘇州卓鑫生物科技有限公司；吡啶、咪唑、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑、亞油酸、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、石油醚、二氯甲烷(均為分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(蘇州威爾實驗用品有限公司)；MS304S分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；GZX-GFC101-1-S電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博泰實驗設備有限公司)；GWA-UN1F-F10超純水機(上海普析分析儀器有限公司)；HYG恒溫搖瓶柜(上海欣蕊自動化設備有限公司)；AWD-ZN-10L全自動滅菌發(fā)酵罐(浙江百力仕龍野輕工裝備有限公司)；CL5R大容量冷凍離心機(上海圣科儀器設備有限公司)；UV1780紫外可見分光光度計[島津儀器(蘇州)有限公司]；HTZ-6020L數(shù)顯真空干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.3 番茄紅素的發(fā)酵制備工藝

三孢布拉氏霉菌正菌株和負菌株分別活化后在28 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h。隨后先將負菌株按一定比例接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，24 h后再將正菌株按一定比例接入發(fā)酵罐培養(yǎng)。發(fā)酵42 h時，添加代謝流阻斷劑，檢測菌體生長量、番茄紅素含量。當番茄紅素含量不再增加，發(fā)酵終止。發(fā)酵前期攪拌速度設定為200 r·min-1，42 h后攪拌速度設定為280 r·min-1。整個發(fā)酵過程通風比1∶0.6；溫度28 ℃。

1.4 番茄紅素的定量檢測

準確稱取番茄紅素標準品2 g，利用20 mL二氯甲烷溶解后用石油醚定容至100 mL，迅速將上述標準溶液稀釋成不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1)于502 nm處測定吸光度，繪制番茄紅素含量標準曲線[16]。

將發(fā)酵液離心(4 000 r·min-1,5 min)用超純水洗滌3次，105 ℃恒定質量后稱重，計算菌體生物量[17]。洗滌后的菌體在40 ℃真空干燥后研磨破壁，用石油醚萃取至溶液無色，合并萃取液轉入棕色容量瓶中，用石油醚定容。以石油醚為參照在502 nm處測定吸光度值，用標準曲線計算出番茄紅素含量[18]。

1.5 單因素實驗

1.5.1 正負菌株接種比例對番茄紅素合成的影響 三孢布拉氏霉菌分為正菌和負菌，只有2種菌混合培養(yǎng)時才能獲得高產(chǎn)量的番茄紅素，負菌是主要的生產(chǎn)菌，正菌作為配對菌株提供三孢酸等激素刺激負菌中番茄紅素合成[19]。正負菌接種比例對發(fā)酵液中菌絲體形態(tài)有較大影響，增加負菌在混合培養(yǎng)過程中的優(yōu)勢，可以提高番茄紅素的產(chǎn)量[20]。選擇1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1負正菌株接種比例進行接種培養(yǎng)，考察接種比例不同對番茄紅素合成的影響。

1.5.2 代謝流抑制劑對番茄紅素合成的影響

在三孢布拉氏霉菌的代謝過程中，最終產(chǎn)物是β-胡蘿卜素而不是番茄紅素，而β-胡蘿卜素是由番茄紅素經(jīng)過番茄紅素環(huán)化酶的催化生成，為獲得大量番茄紅素，必須抑制番茄紅素環(huán)化酶活性。通過添加抑制劑的方法阻斷番茄紅素向β-胡蘿卜素的環(huán)化反應，進而提高番茄紅素的生物合成轉化率，含氮類雜環(huán)化合物(如吡啶、咪唑及其衍生物)均具有阻斷作用[21-23]。分別選用0.05 g·L-1的吡啶、咪唑、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑4種阻斷劑，考察其對番茄紅素發(fā)酵的影響。

1.5.3 外源性植物油對番茄紅素合成的影響

在番茄紅素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，外源性植物油被菌體分泌的胞外脂肪酶分解吸收，菌體內脂肪酸飽和度增加，其分解產(chǎn)物乙酰輔酶A不僅可進入三羧酸循環(huán)，為細胞生長提供能量，還可作為脂肪和番茄紅素合成的共同前體物質[24]。分別選用3 g·L-1的大豆油、菜籽油、花生油、玉米油作為外源性植物油，考察其對菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)量的影響。

1.6 響應面法優(yōu)化番茄紅素的發(fā)酵制備工藝

在采用響應面分析法時，實驗中得到的響應面擬合方程在靠近番茄紅素最高產(chǎn)區(qū)才能較好地反映真實情況，所以應該先逼近最高番茄紅素產(chǎn)區(qū)后再建立有效的擬合方程。根據(jù)單因素法篩選出的顯著因子效應設定它們的變化步長，進行最陡爬坡實驗，尋找最高番茄紅素產(chǎn)區(qū)。根據(jù)Box-Behnken原理進行設計，實驗因素和水平見表1。

表1 響應面分析實驗水平表Table 1 Response surface analysis experiment level table

1.7 統(tǒng)計分析

每個實驗點數(shù)據(jù)獨立進行3次以上，利用Design-Expert、origin 8.5、Microsoft 2013對數(shù)據(jù)進行處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 番茄紅素標準曲線

準確稱取番茄紅素標準品2 g，用20 mL二氯甲烷溶解后再用石油醚定容至100 mL制成番茄紅素標準液，將上述標準溶液稀釋成不同濃度的標樣于502 nm處測定吸光度。如圖1所示，根據(jù)番茄紅素含量和吸光值的線性關系，建立番茄紅素標準曲線，擬合出回歸方程：y=0.277 9x+0.038 2，R2=0.997 9。根據(jù)回歸方程R2可知，在0～3.0 g·L-1范圍內，番茄紅素含量與吸光值具有良好的線性關系。

圖1 番茄紅素含量標準曲線Fig.1 Standard curve of lycopene

2.2 單因素實驗

2.2.1 正負菌株接種比例對番茄紅素合成的影響 為了考察三孢布拉氏霉菌正負菌株接種比例對番茄紅素合成的影響，發(fā)酵時，負菌∶正菌分別按比例1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1接種，發(fā)酵結束后，菌體生物量與番茄紅素產(chǎn)量如圖2所示。可以看出，接種比例過小，出現(xiàn)負菌生長慢的劣勢；接種比例過大，導致正菌的生長受阻，不能為負菌提供足夠的三孢酸等刺激物，從而導致番茄紅素產(chǎn)量下降。結果表明，負菌∶正菌接種比例8∶1時，番茄紅素產(chǎn)量最高，達到1.22 g·L-1，因此，負菌∶正菌接種最佳比例為8∶1。

2.2.2 代謝流抑制劑對番茄紅素合成的影響

為了考察代謝流抑制劑對番茄紅素合成的影響，分別向培養(yǎng)基中添加0.05 g·L-1吡啶、咪唑、2，6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑，CK為對照組(無添加)，發(fā)酵結束后，菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量如圖3所示?？梢钥闯?，不同抑制劑對番茄紅素合成轉化率影響不同，吡啶和咪唑的抑制效果比它們的衍生物差，效果最好的是2,6-二甲基吡啶，番茄紅素含量提高了62.5%。因此，選擇2,6-二甲基吡啶為最佳代謝流抑制劑。

2.2.3 外源性植物油對番茄紅素合成的影響

為了考察外源性植物油對番茄紅素合成的影響，分別向培養(yǎng)基中添加3 g·L-1大豆油、菜籽油、花生油、玉米油，CK為對照組(無添加)，發(fā)酵結

圖2 正負菌株接種比例對番茄紅素合成的影響Fig.2 Effect of the ratio of positive and negative strains on the concentration of lycopene

圖3 環(huán)化酶抑制劑對番茄紅素合成的影響Fig.3 Effect of different cyclase inhibitors on the concentration of lycopene

束后，菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量如圖4所示。可以看出，添加大豆油后單位菌體番茄紅素產(chǎn)量較其他實驗組高，生物量提高了35.7%，番茄紅素含量提高了39.6%，這可能是因為大豆油富含亞油酸有利于生物量的提升，促進了番茄紅素的合成。綜合考慮，選擇大豆油作為外源性植物油輔助發(fā)酵。

圖4 外源性植物油對番茄紅素合成的影響Fig.4 Effect of different plant oils on the >concentration of lycopene

2.3 響應面法優(yōu)化番茄紅素的發(fā)酵制備工藝

2.3.1 響應面實驗設計結果及方差分析 選取負正菌株體積比例(A)、2，6-二甲基吡啶濃度(B)、大豆油濃度(C)3個因素進行響應面設計，以番茄紅素的產(chǎn)量為響應值；根據(jù)Box-Behnken原理設計了3因素3水平共20個試驗點的響應面中心組合實驗。實驗設計及結果見表2。

運用Design-Expert軟件分析表2實驗數(shù)據(jù)，擬合出的方程模型為：

Y=1.41-0.027A+0.15B+0.071C-0.032AB+0.065AC-0.035BC-0.043A2-0.061B2-0.034C2

響應面模型的方差分析如表3所示。由表3可知，一次項B、C和二次項C2對番茄紅素的產(chǎn)量有極顯著影響，二次項B2與交互項AB、AC、BC對番茄紅素產(chǎn)量有顯著影響。說明進行實驗的因素與番茄紅素的產(chǎn)量不是簡單的正比關系。同時響應面模型極度顯著，失擬項對番茄紅素的產(chǎn)量影響不顯著，說明非實驗因素對實驗影響程度較低，可以用此模型進行番茄紅素產(chǎn)量的模擬；系數(shù)R2為0.923 2，說明該回歸模型與實際結果擬合較好。此外，一次項A對番茄紅素的產(chǎn)量無顯著影響，但其在單因素實驗中表現(xiàn)出對番茄紅素產(chǎn)量的明顯影響，具體原因在后續(xù)實驗計劃中會繼續(xù)考察。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface experiment design and results

表3 二階回歸模型方差分析表Table 3 Table of variance analysis of second order regression model

注：*和**分別表示差異在P<0.05和P<0.01水平上具有統(tǒng)計學意義。

2.3.2 響應面圖和等高線圖分析 考慮到番茄紅素的單位產(chǎn)量較其他發(fā)酵產(chǎn)品而言，產(chǎn)量較低且提高較困難，因此需要密切關注能夠促使其增產(chǎn)的一切因素。為了更直觀地反映各因素間交互作用顯著程度，根據(jù)回歸方程做出各因素對番茄紅素產(chǎn)量的響應面圖和等高線圖。其中，等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。從圖5可知，負正菌株接種比例、2,6-二甲基吡啶和大豆油的含量兩兩交互作用對番茄紅素產(chǎn)量的影響均顯著，其響應面圖對應的等高線圖均呈橢圓。

圖5 影響番茄紅素產(chǎn)量的各因素響應面圖和等高線圖Fig.5 Response curves and contour map of the factors influencing lycopene yield

通過模型對培養(yǎng)基最優(yōu)配比的預測可知，當培養(yǎng)基中負菌∶正菌體積比為6∶1、2，6-二甲基吡啶0.09 g·L-1、大豆油濃度3.57 g·L-1時，番茄紅素產(chǎn)量達到最大值(1.53 g·L-1)。用此工藝條件進行5次發(fā)酵，實際平均發(fā)酵產(chǎn)量為1.51 g·L-1，菌體生物量51 g·L-1，說明該模型可以較好地預測實際發(fā)酵情況。

3 討論

番茄紅素作為一種對人體有益的類胡蘿卜素，其抗癌抑癌、抗氧化性、細胞生長代謝調控等特征在大健康及醫(yī)療領域將會產(chǎn)生巨大的作用。然而，傳統(tǒng)的提取方法和化學合成法無法滿足需求。微生物發(fā)酵法因具有工藝簡單、生產(chǎn)效率高、產(chǎn)物的生物活性與天然植物提取物一致等優(yōu)點，逐漸受到關注，但番茄紅素產(chǎn)量會根據(jù)發(fā)酵菌株的不同而變化。王敏等[25]以1株龜裂鏈霉菌為出發(fā)菌株經(jīng)誘變篩選及工藝優(yōu)化使番茄紅素的產(chǎn)量達到230 mg·L-1；汪福源等[26]通過誘變紅酵母，獲得可生物合成番茄紅素的RY-17菌株，其在優(yōu)化后的工藝條件下番茄紅素的產(chǎn)量僅為5.53 mg·L-1；任龍[27]以三孢布拉霉為出發(fā)菌株，經(jīng)過2次的誘變篩選，在最優(yōu)的工藝條件下番茄紅素的產(chǎn)量可達1.295 g·L-1。由此可見，三孢布拉霉是目前發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)量最優(yōu)的菌株。

本研究在單因素實驗的基礎上利用響應面法優(yōu)化代謝控制條件，最終確定當三孢布拉氏霉菌負正菌株接種比例6∶1，添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑2,6-二甲基吡啶0.09 g·L-1，以3.57 g·L-1大豆油為外源性植物油輔助發(fā)酵時，可使發(fā)酵液中的番茄紅素產(chǎn)量達1.51 g·L-1，菌體生物量51 g·L-1。本研究通過培養(yǎng)基的優(yōu)化可以使番茄紅素的產(chǎn)量穩(wěn)定的維持在1.5 g·L-1，相對于任龍[27]的研究，番茄紅素的產(chǎn)量提高了15個百分點，離番茄紅素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)更近一步。然而，利用發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量依舊較低，這意味著今后在提高番茄紅素產(chǎn)量的方面需要繼續(xù)探索，可通過外源添加提高產(chǎn)量，如維生素輔酶、還原力(NADP、NADPH)、前體、中間代謝產(chǎn)物的不斷優(yōu)化可能會使番茄紅素的產(chǎn)量繼續(xù)提高。