楊鎮(zhèn)州 劉剛 許麗

（上海市計量測試技術研究院，上海 201203）

近年來，隨著生物技術及相關專業(yè)的發(fā)展，針對轉基因作物的研究和應用愈發(fā)廣泛，截至2018 年底，全球轉基因作物種植面積已達1.917 億hm2［1］；與此同時，各國家和地區(qū)對于轉基因作物的安全管理也日趨嚴格，開始實施標識制度和系統(tǒng)化管理［2］。

RNA 干擾（RNAi，RNA interference）作為一種新興的熱門轉基因生物技術，常指一些短鏈的雙鏈RNA（dsRNA）可以通過促使特異性mRNA 降解來高效地阻斷生物體內特異性基因的表達［3］。該技術在基因功能研究領域發(fā)揮了重要作用，并被認為是極具應用潛力的育種新方法，已在轉基因番茄、馬鈴薯等作物上實現(xiàn)了深入研究［4-6］。但由于RNAi 技術存在沉默機制的特異性可能在傳代、生長環(huán)境等過程中產(chǎn)生變化、沉默在物種間可能產(chǎn)生的漂移、偶然性觸發(fā)等因素，RNAi 轉基因作物的安全評價便顯得尤為重要，但目前國內外尚未見對RNAi 轉基因植物有權威的評價及管理方法，這將對我國轉基因安全監(jiān)管十分不利。因此，尋找到RNAi 轉基因植物的高效檢測方法，對其進行精確定量的意義 重大。

目前，針對轉基因產(chǎn)物定量檢測主要依靠PCR技術［7］。實時熒光定量PCR 技術（Real-time PCR）和普通PCR 法相比靈敏度更高，并且能對基因拷貝數(shù)進行定量。但由于它是依靠Ct 值和標準曲線進行相對定量的，因此對于低拷貝數(shù)和來源復雜樣品的檢測有很大的局限性［8］。隨著PCR 技術的不斷發(fā)展，第三代數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）以其靈敏度高、絕對定量精確、檢測線性范圍寬、特異性好等優(yōu)勢脫穎而出。dPCR 采用分散手段，將完整的PCR體系分散至成千上萬個獨立體系中，使得每個獨立PCR 體系中至多包含一個模板（實際樣品中的模板數(shù)符合泊松分布），并對這些體系是否發(fā)生了PCR反應進行檢測從而達到精確的絕對定量［9］。由于上述多種優(yōu)勢，dPCR 技術在近年來飛速發(fā)展，已經(jīng)多次被應用于轉基因成分的定量檢測實驗研究中［10］。

我國作為農業(yè)大國，在過去數(shù)十年中一直致力于開發(fā)用于作物抗昆蟲侵襲的方法。以前采用的傳統(tǒng)手段如化學殺蟲劑等，雖效果較理想，但對非目標生物如蚯蚓等也會造成傷害；并且由于其難以代謝，長期使用會導致田野貧瘠；更嚴重的是會積累于食物鏈中，對更高端物種將會誘導疾病的產(chǎn)生。RNAi 能以序列特異性方式下調基因的表達，在害蟲防治方面的應用已較為成熟。本研究中選用的轉基因玉米DBN11061，是一種利用RNAi 技術以降低或關閉昆蟲體內靶序列表達來削弱昆蟲存活、繁殖或是侵襲寄主能力的玉米品系。本研究中將以該轉基因玉米品系的特異性dsRNA 為實驗目標，建立并優(yōu)化其逆轉錄數(shù)字PCR（RT-dPCR）定量檢測方法，為RNAi 轉基因作物的定量檢測和基于RNAi 技術的轉基因作物安全評價做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

RNAi 轉基因玉米DBN11061（北京大北農生物技術有限公司）；植物RNA 提取試劑盒（ExtrationKits，ET Kits）（PureLinkTMRNA Mini Kit，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；柱式植物總 RNA 抽提純化試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，寶生物工程（大連）有限公司）；反轉錄試劑盒（Reverse Transcription Kits，RT Kits）（ProtoScriptcDNA 第 一 鏈 合 成 試 劑 盒，NEB（北京）有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，寶生物工程（大連）有限公司；Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；引物、探針合成（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；數(shù)字PCR 系統(tǒng)（QuantStudioTM3D，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；核酸定量儀（Nanodrop2000，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物探針的設計 針對轉基因玉米DBN11061中引發(fā)特異序列基因沉默的dsRNA 序列設計dPCR正反向引物及探針。

1.2.2 轉基因玉米總RNA 的抽提方法優(yōu)化 在提取過程中，均先使用液氮將葉片磨成粉末，再分別使用不同方法對轉基因玉米葉片進行總RNA 提取，得到的RNA 存放于-80℃。使用同一反轉錄方法對RNA 進行反轉錄后得到cDNA，并按照QuantStudioTM3D 數(shù)字PCR 儀默認程序進行數(shù)字PCR并比較結果，實驗均重復3 次。

1.2.3 RNA 反轉錄為cDNA 的方法優(yōu)化 使用

1.2.2 中最優(yōu)提取方法得到的轉基因玉米葉片RNA按照不同方法進行反轉錄，得到的cDNA 按照QuantStudioTM3D 默認程序進行數(shù)字PCR 并比較結果，實驗均重復3 次。

1.2.4 數(shù)字PCR 反應條件的優(yōu)化 不同的模板及引物探針所需的最佳反應條件均不相同，其中退火溫度為最關鍵因素。我們選擇的dPCR 反應條件為：（1）酶激活和預變性階段：96℃，10 min；（2）循環(huán)擴增階段：60、58、56、54 和52℃（不同退火溫度）/2 min，98℃/30 s，共40 個循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s，分別根據(jù)不同退火溫度進行數(shù)字PCR 并比較結果。

1.2.5 數(shù)字PCR 反應體系的優(yōu)化 數(shù)字PCR 方法的準確性和反應體系中的引物、探針濃度密切相關，針對轉基因玉米DBN11061 中dsRNA 序列PCR 反應體系中的引物、探針濃度進行優(yōu)化。dPCR 反應體系（總體積為20 μL）中，分別選取探針終濃度為：10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L；外源基因的正反向引物終濃度為50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、1 000 nmol/L；Master mix 體積為10 μL，H2O 體積為8 μL，依次根據(jù)1.5 中最優(yōu)反應條件進行數(shù)字PCR 并比較結果。

1.2.6 實驗方法的定量檢測低限的測定 將cDNA樣品依次稀釋1、10、20、50、100 倍，根據(jù)1.2.4 及1.2.5的反應體系及條件進行dPCR，每個擴增實驗重復3次，并計算測得平行數(shù)據(jù)的RSD 值，以相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）≤25%［11］作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷依據(jù)，判斷本文建立的dPCR體系定量檢測低限的濃度值。

2 結果

2.1 引物探針的設計

針對轉基因玉米品系DBN11061 的dsRNA 序列進行引物探針設計，序列如表1。

表1 引物及探針序列

2.2 轉基因植物總RNA的提取方法優(yōu)化

不同的植物總RNA 提取方法的原理基本類似，提取流程主要包括：（1）加入液氮充分研磨，以徹底破碎植物細胞的細胞壁；（2）使核蛋白復合體中的蛋白質變性，致使蛋白質與核酸分離；（3）抑制RNA 酶活性，以防止釋放出的RNA 被污染；（4）分離RNA 與DNA、蛋白質、酚類物質、多糖等；（5）溶解并得到總RNA，檢測質量與濃度。本實驗主要選取3 種轉基因植物總RNA 提取試劑盒，在稱取相同質量的轉基因玉米葉片提取得到RNA 后，使用同種反轉錄方法得到cDNA，再運用同種反應體系與條件進行數(shù)字PCR，通過比較數(shù)字PCR 的結果篩選出相對最優(yōu)的提取方法。實驗結果如圖1。

取等體積RNA 進行逆轉錄后，將得到的cDNA按1.2.4、1.2.5 的PCR 體系（引物終濃度為200 nmol/L，探針終濃度為50 nmol/L）及反應條件（退火溫度為52℃）進行數(shù)字PCR 擴增，并比較各提取方法得出的結果。

綜合3 種提取方法得到RNA 的dPCR 結果，我們發(fā)現(xiàn)，ET-Kit3 提取得的RNA 經(jīng)過反轉錄后得到的cDNA 在進行dPCR 實驗中，信號區(qū)分最顯著、閾值線易劃分。因此后續(xù)相關轉基因玉米RNA 提取實驗均采用ET Kit 3。

2.3 轉基因植物RNA的反轉錄方法優(yōu)化

反轉錄反應過程為：（1）65℃反應不同時間，冰上冷卻，以使RNA 變性，打開其二級結構；（2）加入隨機引物、dNTP、buffer、逆轉錄酶在較低溫度（不同提取方法溫度不同）反應，以使引物與模板RNA退火結合；（3）在逆轉錄酶工作溫度（不同提取方法溫度不同）下反應；（4）變性：使合成的cDNA和RNA 區(qū)分開；（5）在較高溫度（不同提取方法溫度不同）反應，以使逆轉錄酶失活。在上述實驗過程中，RNA 逆轉錄酶的活性和效率至關重要。因此我們選擇3 種不同的條件進行dPCR，篩選最優(yōu)的反轉錄方法。

結果（表2）發(fā)現(xiàn)，RT Kit B 的逆轉錄效率遠高于另兩種方法，因此后續(xù)實驗所涉及的反轉錄步驟均使用RT Kit B。

2.4 數(shù)字PCR反應條件及體系優(yōu)化

2.4.1 數(shù)字PCR 反應條件的優(yōu)化 在PCR 反應中，退火溫度是最重要的參數(shù)。在反應過程中，退火溫度需要足夠低，以確保引物和目的序列有效退火；并且還需要足夠高，以減少非特異性結合。在dPCR反應過程中，合理的退火溫度約為60℃。本文中分別選取退火溫度為60、58、56、54 和52℃并按照

圖1 不同反應提取方法得到的dPCR 芯片圖

表2 三種反轉錄方法得到cDNA 的dPCR 濃度結果

1.2.5 中的PCR 體系（引物終濃度為200 nmol/L，探針終濃度為50 nmol/L）依次獨立進行實驗，以優(yōu)化得到最佳退火溫度。根據(jù)實驗結果的芯片圖（圖2）我們可以發(fā)現(xiàn)，當退火溫度為60-56℃時，信號尚區(qū)分不明顯，閾值線不能明確劃分；當降至52℃時，信號區(qū)分最明顯，閾值線顯著。因此dPCR 反應條件確定為：酶激活和預變性階段：96℃，10 min；循環(huán)擴增階段：52℃/2 min，98℃/30 s，共40 個循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s。

2.4.2 數(shù)字PCR 反應體系的優(yōu)化 數(shù)字PCR 方法的準確性和反應體系中的引物、探針濃度密切相關，直接關系到陽性信號和陰性信號的區(qū)分，以及后續(xù)dPCR 結果的準確度，為此，我們對引物、探針濃度進行了優(yōu)化，依次進行dPCR。

2.4.2.1 探針濃度的優(yōu)化 按照1.2.5 中體系，分別選取探針終濃度為：10、25、50、75、100 nmol/L依次進行dPCR，結果如圖3，當探針終濃度為50 nmol/L 時，信號區(qū)分最佳，因此確定該濃度為探針濃度。

2.4.2.2 引物濃度的優(yōu)化 按照1.2.5 中體系，采用外源基因的正反向引物終濃度為50、100、200、400、1 000 nmol/L，依次進行dPCR，結果如圖4。當引物終濃度為200 nmol/L 時信號區(qū)分最佳，因此確定200 nmol/L 為引物終濃度。

2.5 實驗方法的定量檢測低限

為了得到通過上述實驗所建立方法的定量檢測低限，我們將使用ETKit 3 試劑盒提取得到的RNA（600 ng/μL）使用RT Kit B 反轉錄后得到的cDNA 依次稀釋1、10、20、50、100 倍，并依照2.4 中得到的最佳反應體系及條件進行數(shù)字PCR，結果如表3。

圖2 不同反應條件得到的dPCR 芯片圖

當cDNA 模板稀釋至50 倍時，檢測濃度為21.7 copies/μL，RSD 為14.6%，小于轉基因成分定量檢測平行數(shù)據(jù)RSD 為25%的接受閾值［11］，可以用于轉基因的定量檢測。而當檢測空白樣品時，平均值為1.8 copies/μL，標 準差為0.23 copies/μL，RSD為12.4%，根據(jù)定量檢測中LOD 的計算方法，判定本文建立的dPCR 體系絕對定量檢測低限約為2.5 copies/μL。

3 討論

圖3 不同探針濃度得到的dPCR 芯片圖

在我國，由于害蟲侵襲造成危害的區(qū)域已逐漸從西北等地蔓延到東北、華北等玉米主要生產(chǎn)區(qū)域。因此，研究出能控制昆蟲蟲害并對植物損害較小的方法一直是相關領域研究者的目標。本研究中提及的RNAi 技術通過下調靶序列來控制昆蟲的侵襲，例如破壞昆蟲生長必須的生物過程［12］。當特定的靶序列表達被下調或抑制時，會減少至少30%的蟲害威脅。此外，這些靶序列可以僅在昆蟲的生長特定階段表達。本實驗以DBN11061 品系中dsRNA 序列為目標，設計引物探針進行dPCR 定量檢測，從玉米的總RNA 提取方法、RNA 反轉錄方法、dPCR 退火溫度、所用引物探針濃度等方面均進行條件優(yōu)化，從而建立了一套完整的轉基因玉米RT-dPCR 定量檢測方法。

圖4 不同引物濃度得到的dPCR 芯片圖

在得到轉基因品系玉米的cDNA 過程中發(fā)現(xiàn)，用ET-Kit 3 提取試劑盒所得RNA 的濃度及純度優(yōu)于其他兩種提取方法；在反轉錄過程中，針對不同的總RNA，不同的反轉錄酶活性也大相徑庭。在本實驗中RT-Kit B 反轉錄活性顯然優(yōu)于其他兩種反轉錄酶。因此后續(xù)實驗檢測所用的cDNA 均由ET-Kit 3 提取玉米中的總RNA 后，使用RT-Kit B 進行反 轉錄。

在數(shù)字PCR 的體系及反應條件優(yōu)化過程中我們將反應條件確定為：酶激活和預變性階段：96℃，10 min；循環(huán)擴增階段：52℃/2 min，98℃/30 s，共40 個循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s；反應體系為總體積為20 μL 中，探針終濃度為50 nmol/L，外源基因的正反向引物終濃度為200 nmol/L，Master mix 體積為10 μL，H2O 體積為8 μL，模板為2 μL。

表3 稀釋不同倍數(shù)cDNA 的數(shù)字PCR 結果

依照本文建立的數(shù)字PCR 檢測方法，絕對定量檢測低限約為2.5 copies/μL，RSD 為12.4%；低濃度實際樣品達21.7 copies/μL 時，相對偏差為2.7%，RSD 為14.6%，優(yōu)于歐盟的轉基因定量標識限［13］。

與傳統(tǒng)PCR 相比，本實驗所采用的dPCR 更高效、更穩(wěn)定，且由于不需要制作標準曲線，也避免了昂貴的標準物質的使用和PCR 擴增效率差異對實驗結果的影響。將本實驗構建并優(yōu)化的方法應用于轉基因RNAi 品系玉米dsRNA 檢測研究，將為我國轉基因作物的定量檢測工作提供技術支撐和方法 依靠。

4 結論

本研究針對基于RNAi 技術的轉基因玉米品系，通過對植物提取方法、逆轉錄方法、數(shù)字PCR 條件及體系的摸索，建立了一套逆轉錄芯片式數(shù)字PCR定量檢測該品系玉米雙鏈RNA 的方法，該方法的絕對定量檢測低限約為2.5 copies/μL，RSD 為12.4%。