鄧春艷， 王晗月， 李 寧， 蔣豆蔻， 俞麗娜， 歐陽志斌， 李富榮△

［暨南大學第二臨床醫(yī)學院（深圳市人民醫(yī)院）1生物治療室，2轉(zhuǎn)化醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心，深圳市干細胞研究與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室，廣東深圳518020；3暨南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，廣東廣州510632］

據(jù)世界衛(wèi)生組織最新公布數(shù)據(jù)顯示，糖尿病已成為緊隨心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第3大疾病。盡管糖尿病患者可以通過補充胰島素非常有效地控制血糖，但與健康患者相比，接受治療的患者總體預期壽命縮短、生活質(zhì)量改善，因此目前的研究主要是利用多種方法來產(chǎn)生功能完整的胰島素分泌細胞（insulin-producing cells，IPCs）［1］。干細胞在一定條件下能誘導分化為IPCs，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島β細胞替代物的新資源［2］。但是，體外干細胞（包括胚胎干細胞、誘導多能干細胞和成體干細胞）分化為胰島β細胞效率低、成熟度差的問題限制著臨床應用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在干細胞自我更新和分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，調(diào)控某種特異性miRNA表達，可以促進干細胞向特定組織細胞的定向分化［3］。miR-375在人類和小鼠的胰島中是表達最強的一種miRNA，對胰島β細胞的成熟具有重要的作用［4］。miR-375前體經(jīng)過在5′端和3′端的加工處理后可以形成miR-375-5p和miR-375-3p兩個成熟的miRNAs，目前miR-375-5p的功能尚不明確，多數(shù)研究中證實的對胰島發(fā)育具有重要調(diào)控作用的是miR-375-3p。因此，本研究通過構建miR-375-3p過表達體系，探討miR-375過表達對人類誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）向 IPCs分化的影響及可能機制。

材料和方法

1 材料及試劑

hiPSCs系NF1-4-iPS-C11為中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈，它是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染OCT4、SOX2、c-Myc和Klf4基因?qū)肴似つw成纖維細胞重編程而產(chǎn)生的；人胰腺細胞系HPC-Y5來源于上海中科院細胞庫。mTeSRTM1培養(yǎng)基購自STEMCELL Technologies；Matrigel購自BD；胰酶購自Hy-Clone；誘導分化過程中使用的DMEM/F12、F12、IMDM、DMEM/H、ITS-X supplement、B-27 supplement和N-2 supplement均購自Gibco；wortmannin購自Selleck；nicotinamide、exendin-4和retinoic acid（RA）購自Sigma；抗堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、骨形成蛋白 4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、胰島素和C肽抗體購自PeproTech；總RNA提取試劑TRIzol購自Life；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit和real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa；One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit和SPoly（T）plus miRNA qPCR-assay primer set購自深圳市盎然生物科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；LipofectamineTM2000購自 Invitrogen；Dual-Luciferase?Reporter（DLRTM）Assay System購自Promega。

2 主要方法

2.1 hiPSCs的培養(yǎng) 采用無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)方式，hiPSCs生長在Matrigel包被的培養(yǎng)皿中，用mTeSRTM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天更換新鮮的培養(yǎng)基。當細胞鋪板率達到80%～90%時進行傳代。

2.2 過表達miR-375的hiPSCs系的建立 采用Primer Premier 5.0軟件設計并合成miR-375-3p的引物（5′-CGCCGCGGCCGCCGACGTGTCAGC-3′和 5′-GACTGCGGCCGCACAGCCTCTCCCACCCGTACGG-3′），PCR擴增片段后克隆至慢病毒載體CV130-SV40-puromycin，引物的合成及慢病毒原液的制備均由上海吉凱基因化學技術有限公司完成，同時構建空載體對照組。

2.3 hiPSCs的體外誘導分化 干細胞向IPCs分化的經(jīng)典誘導方法參照文獻［5］。第1階段（第0～4天）：誘導液為DMEM/F12中添加0.2%BSA、0.5×N-2 supplement、0.5× B-27 supplement、100 μg/L activin A和1μmol/L wortmannin，每天更換新鮮誘導液，連續(xù)誘導4 d；第2階段（第4～8天）：誘導液為F12與IMDM以1∶1比例混合，添加0.5%BSA、0.5× ITS-X supplement、0.5× B-27 supplement、2 μmol/L RA、20 μg/L FGF7和50μg/L Noggin，混合均勻，每天更換新鮮誘導液，連續(xù)誘導4 d；第3階段（第8～13天）：誘導液為DMEM/H中添加0.5%BSA、1×ITS-X supplement、1× N-2 supplement和50 μg/L EGF，混合均勻，每天更換新鮮誘導液，連續(xù)誘導5 d；第4階段（第13～21天）：誘導液為 DMEM/F12中添加 1× ITS-X supplement、10 μg/L bFGF、50 μg/L exendin-4、10 μg/L BMP4和10 mmol/L nicotinamide，混合均勻，每天更換新鮮誘導液。實驗分為hiPSCs組（正常hiPSCs組）、miR-375-hiPSCs組（miR-375過表達組）和NeghiPSCs組（空載體對照組），各組細胞均按照上述方法進行誘導。誘導期間收集各組第0、7、14和21天的細胞用于后續(xù)監(jiān)測。流式細胞術及C肽抗體染色檢測各誘導階段的分化效率。誘導結束采用免疫熒光染色檢測胰島素蛋白表達。通過體外葡萄糖刺激實驗ELISA試劑盒測定誘導的IPCs釋放的胰島素和C肽含量來評估成熟度，并與人胰腺細胞系HPC-Y5來源的正常胰島細胞對比。

2.4 S-Poly（T）plus RT-qPCR法檢測miRNA-375的表達 將待檢測細胞提取總RNA，按照TRIzol總RNA提取試劑盒的操作說明書進行，測定純度和濃度后按照One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit說明書建立反應體系合成cDNA，按照S-Poly（T）Plus miRNA qPCR-assay說明書配制反應體系檢測 miR-375（hsa-miR-375-3p，編號 MIMAT0000728，序列為 5′-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3′），以SNORD44為內(nèi)參照，反應條件為：95℃ 3 min；95℃10 s，60℃ 30 s，40 cycles。以第0天的正常 hiPSCs作為對照，采用2-ΔΔCt法計算miR-375的相對表達水平。

2.5 real-time PCR法檢測各階段標志性基因的表達 誘導期間收集的各組細胞，按照TRIzol總RNA提取試劑的操作說明書進行總RNA的提取，測定純度和濃度后按照試劑盒說明書建立反應體系合成cDNA并完成real-time PCR檢測（引物序列見表1），動態(tài)監(jiān)測各組hiPSCs分化為胰腺β細胞的過程中相關轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、Pax6、Nkx6.1、MafA、insulin、glucokinase和HNF4α的表達變化，以GAPDH為內(nèi)參照，反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40 cycles。以第0天的正常hiPSCs作為對照，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used for real-time PCRanalysis

2.6 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?采用生物信息學軟件（miRDB和TargetScan）預測miR-375可能的靶基因，構建含靶基因3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′UTR）序列的螢光素酶報告基因載體和含miR-375的表達質(zhì)粒，將兩者共轉(zhuǎn)染293T細胞，通過化學發(fā)光儀檢測螢光素酶的活性，若活性降低，則通過驗證；如果驗證正確，則構建含有miRNA突變靶位點的螢光素酶報告基因載體，再次進行驗證。

2.7 miR-375-hiPSCs中靶基因表達水平的檢測分別采用real-time PCR（方法同前）和Western blot檢測各組細胞中靶基因的mRNA和蛋白表達水平，驗證調(diào)控是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平。Western blot方法如下：各組細胞經(jīng)RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度后定量，加等量蛋白于加樣孔中，順序完成電泳、半干法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、I抗孵育及洗膜、II抗孵育及洗膜、顯色，βactin作為內(nèi)參照，顯影之后Quantiy One軟件對條帶進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析處理采用SPSS 19.0軟件。所有數(shù)據(jù)分析采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 過表達miR-375的hiPSCs系的構建

將過表達miR-375的慢病毒和陰性對照病毒分別感染hiPSCs，嘌呤霉素篩選5 d后收取miR-375-hiPSCs和 Neg-hiPSCs的樣本，S-Poly（T）plus RT-qPCR法檢測miR-375的表達水平。Neg-hiPSCs與較未轉(zhuǎn)染的hiPSCs相比miR-375表達水平差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），miR-375-hiPSCs的miR-375表達水平較Neg-hiPSCs提高約10倍（P＜0.05），見圖1A。

2 IPCs的分化效率及成熟度

IPCs誘導結束后，免疫熒光檢測miR-375-hiPSCs組和空載體組胰島功能標志性蛋白胰島素的表達和定位。結果顯示，胞漿內(nèi)可見胰島素表達，且miR-375-hiPSCs組的表達率顯著高于空載體組，見圖1B。

Figure 1.The expression of miR-375 in different hiPSCs groups（A）and the expression of insulin in induced miR-375-hiPSCs and Neg-hiPSCs into IPCs（B；21 d after induction，×200）.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group.圖1 不同組別hiPSCs中miR-375的表達及hiPSCs向IPCs分化后胰島素蛋白的表達

流式細胞術結果顯示，對照hiPSCs和NeghiPSCs經(jīng)四步法誘導21 d分化為IPCs，C肽陽性率分別約為（22.5±2.9）%和（23.6±3.4）%，差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），miR-375-hiPSCs組的C肽陽性率提高至（38.6±3.8）%，較上述兩對照組顯著增加（P＜0.01），見圖2A。

miR-375-hiPSCs經(jīng)21 d誘導分化后，將誘導分化的IPCs與成年胰島細胞進行葡萄糖刺激實驗，采用ELISA測定培養(yǎng)上清中釋放的胰島素與C肽含量來評估成熟度。在低糖（2.5 mmol/L）和高糖（27.5 mmol/L）刺激下，對照hiPSCs和Neg-hiPSCs組分化的IPCs釋放的胰島素和C肽含量的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），與miR-375-hiPSCs組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低、高糖刺激下，hiPSCs組和Neg-hiPSCs組分化的IPCs釋放的胰島素和C肽僅為成年胰島細胞釋放量的1/8，而miR-375-hiPSCs分化的IPCs釋放的胰島素和C肽含量為成年胰島細胞釋放量的1/5，見圖2B、C。

Figure 2.The efficiency and maturity of differentiated IPCs from hiPSCs.A：flow cytometric results of C-peptide-positive cells in each group；Band C：the insulin and C-peptide secretion of the differentiated IPCs in each group was compared with that of the adult isletβ cells after glucose tolerance test.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs adult islet group.圖2 誘導分化的IPCs的效率和成熟度檢測結果

3 miR-375-hiPSCs分化過程中基因表達的變化

對細胞分化過程中miR-375進行監(jiān)測：顯示在誘導過程第0、7、14和21天，3組hiPSCs（control、NeghiPSCs和miR-375-hiPSCs）中miR-375的表達均逐漸升高，miR-375-hiPSCs組升高最明顯，與control和Neg-hiPSCs組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Neg-hiPSCs與control之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3A。此結果證明，分化過程中miR-375在miR-375-hiPSCs組細胞中高效過表達。

動態(tài)監(jiān)測hiPSCs分化為IPCs過程中胰腺β細胞發(fā)育相關轉(zhuǎn)錄因子的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-375-hiPSCs組在誘導分化的第7天開始，HNF4α、Pdx1、Pax6和Nkx6.1的表達水平迅速增加，其中Pdx1的表達在第14天達到最高峰，隨后略有下降，但仍維持在較高水平，其余均在第21天達最高峰；glucokinase、MafA及insulin的表達在第0、7和14天均維持在較低水平，第21天迅速達到最高峰；control組和Neg-hiPSCs組在經(jīng)典四步法誘導的基礎上雖然也表現(xiàn)出相應的變化趨勢，但表達量明顯低于miR-375-hiPSCs組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3B～H。這些結果提示miR-375過表達促進了hiPSCs向IPCs分化過程中β細胞發(fā)育關鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達。

Figure 3.The gene expression changes during differentiation in different hiPSCs groups.A：the expression of miR-375 during differentiation at different time points；B～H：the mRNA expression of genes related to the development of pancreaticβ cells during differentiation at different time points.Data were normalized to normal hiPSCs in control group at Day 0.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group at the same time point.圖3 不同組別hiPSCs分化過程中基因表達的變化

4 miR-375靶基因的預測與驗證

TargetScan軟件分析預測發(fā)現(xiàn)miR-375可能的靶基因中與胰腺發(fā)育相關的包括：抑制元件1沉默轉(zhuǎn)錄因子（repressor element-1-silencing transcription factor，REST；又稱神經(jīng)元限制性沉默因子，即neuron restrictive silencer factor，NRSF）和無翅型MMTV整合位點家族成員5A（wingless type MMTV integration site family，member 5A，WNT5A)，其 mRNA 的3′UTR可與miR-375成熟序列的堿基互補配對，即REST和WNT5A很可能是miR-375的作用靶點之一。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示，含有野生型質(zhì)粒的螢光素酶活性明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而含有突變型質(zhì)粒的螢光素酶活性的差異無統(tǒng)計學顯著性，從結構上證實了miR-375與靶基因REST和WNT5A的3′UTR的特異性結合，見圖4A、B。

5 miR-375-hiPSCs中靶基因的表達水平

real-time PCR結果顯示，hiPSCs與miR-375-hiPSCs中REST和WNT5A的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4C；Western blot結果顯示，miR-375-hiPSCs中REST和WNT5A的蛋白表達水平較正常hiPSCs組明顯下降，見圖4D。上述結果提示，miR-375對靶基因REST和WNT5A的影響主要發(fā)生在翻譯水平，符合miRNA對靶基因抑制作用的特點。

Figure 4.Prediction and validation of miR-375 target genes.A：the predicted binding sites of miR-375 with RESTand WNT5A（the red labeled nucleotides were the mutation sites designed in luciferase reporter assay）；B：the relative luciferase activity of wild-type and mutant 3′UTR in 293T cells（NC：negative control）；C：real-time PCR results of REST and WNT5A；D：Western blot for determining the protein levels of REST and WNT5A（β-actin as internal control）.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs NCgroup；#P＜0.05 vs control group.圖4 miR-375靶基因預測與驗證的結果

討 論

miRNA在胰腺發(fā)育、β細胞分化、胰島素分泌及葡萄糖代謝等方面都發(fā)揮著重要的作用［4］。miR-375特異性地表達于胰島細胞中，調(diào)控胰島胚胎發(fā)育過程及成熟胰島β細胞的功能，影響胰島素的合成與分泌，敲除miR-375的小鼠將發(fā)生胰島發(fā)育障礙［6］。胰腺發(fā)育過程中的兩個重要的轉(zhuǎn)錄因子Pdx1和NeuroD1共同作用于miR-375的啟動子及增強子來調(diào)節(jié)miR-375的表達［7］。研究證實在不添加各種細胞因子和小分子化合物的情況下，僅采取過表達miR-375的方式經(jīng)過21 d體外培養(yǎng)就可以分別將iPSCs或胚胎干細胞定向分化為IPCs，但分化效率和成熟度仍欠佳［8-9］；在脂肪干細胞中過表達miR-375后進行誘導也能獲得更多表達胰島素和Pdx1的IPCs［10］。在前期工作中，課題組參考北京大學鄧宏魁教授建立的誘導方案［5］，通過添加各種細胞因子和小分子化合物建立了hiPSCs定向分化為胰島β細胞的方法，分化效率約22.3%。在此基礎上，本項目通過構建慢病毒載體轉(zhuǎn)染miR-375至hiPSCs，過表達miR-375的hiPSCs結合經(jīng)典四步法向IPCs誘導分化的過程中，將有利于胰島β細胞標志性轉(zhuǎn)錄因子HNF4α、glucagon、Glut-2、Nkx6.1、Pdx1、Pax6、NeuroD和Isl-1的表達，明顯提高了分化效率及增強了成熟度上，但與正常成人胰島細胞功能仍存在一定差距。

生物信息學結合螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CREST和WNT5A為miR-375的靶基因，進一步檢測顯示miR-375對REST和WNT5A的影響發(fā)生在蛋白質(zhì)翻譯水平，而非mRNA轉(zhuǎn)錄水平，符合miRNA對其靶基因抑制作用的特點。研究表明，REST蛋白參與調(diào)控胚胎干細胞的自我更新和全能性的維持，及干細胞的定向分化等多個生理過程［11］。一些對胰島素分泌起著重要調(diào)控作用的分子如突觸小體相關蛋白25（synaptosomal-associated protein 25，SNAP25）、突觸結合蛋白4（synaptotagmin 4，SYT4）和連接蛋白36（connexin 36）等，都已證實可以被REST負調(diào)控，因而REST的表達不存在于正常胰島β細胞中，胰島β細胞表達REST將減少胰島素的分泌［12-13］。Li等［14］的研究通過沉默REST基因?qū)⒀蛩蝎@得的干細胞成功誘導為胰島素分泌細胞；另有研究通過體外操控基因表達，即抑制REST和Shh基因，同時過表達Pdx1基因?qū)⑹蠊撬鐼SC分化為可感應葡萄糖變化的IPCs，在他們的研究中抑制REST基因表達是必要的［15］。另一方面，WNT信號通路在胰腺發(fā)育的多個方面都至關重要，其不同層面的信號分子在胰腺組織中均有不同程度的表達［16］。研究提示在誘導hiPSCs向β細胞分化的過程中，添加WNT抑制劑獲得的細胞整體蛋白質(zhì)組學顯示出更類似于成人胰島的蛋白質(zhì)組學特征［17］；WNT5A可誘導大鼠胰島細胞瘤細胞中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II的活化，從而降低細胞穩(wěn)定性連環(huán)蛋白及其核轉(zhuǎn)位，最終降低細胞周期蛋白D1表達，成為抑制β細胞增殖的重要調(diào)控基因［18］。因此我們推測，miR-375有可能通過對REST和WNT5A的抑制，開啟SNAP25、SYT4和connexin 36等與胰島素分泌相關的特異性基因，調(diào)控hiPSCs向IPCs分化。

然而，在個體發(fā)育過程中，細胞分化是一個受到復雜、精確體系調(diào)控的有序規(guī)律過程。從分子水平看，這一結果取決于細胞在基因表達上的時空差異，是一個多基因通路綜合變化的復雜網(wǎng)絡。無論是miR-375或其涉及的可能靶基因，在胰島β細胞的發(fā)育過程中都不是一成不變的，而是一個動態(tài)變化的過程。研究提示miR-375在胚胎胰腺發(fā)育過程呈先高后低的表達規(guī)律，其表達水平在胚胎干細胞定向分化過程第5天達到高峰，然后開始下降，直到分化結束［19］；同時，miR-375過度表達將抑制小鼠胰島β細胞中高糖誘發(fā)的胰島素分泌，內(nèi)源性miR-375的功能被抑制后可促進胰島素分泌［20-21］；也有研究報道m(xù)iR-375上調(diào)可能增加胰島β細胞凋亡［22］。另一方面，WNT5A在胰腺細胞的遷移和框架的構建中也發(fā)揮著積極的作用。盡管有研究提示W(wǎng)NT5A過表達會干擾胰島正常發(fā)育［23］，卻也有研究顯示在小鼠及斑馬魚等動物胚胎模型中，WNT5A在胰島中廣泛表達，WNT5A-/-的小鼠中胰島素陽性細胞的遷移會受到阻礙［24］；給予外源性WNT5A或過表達WNT5A均能抑制胰島星狀細胞生長從而利于胰島素分泌［25］。這種看似矛盾的結果可能正好反映了基因調(diào)控網(wǎng)絡的復雜性和精確性。因此，本研究采用過表達miR-375的hiPSCs結合經(jīng)典四步法向IPCs誘導分化的過程中，雖然在一定程度上能夠提高分化效率和成熟度，但未能完全實現(xiàn)分化過程中基因表達的精準動態(tài)調(diào)控，是形成局限的主要原因。

回顧過去的研究，干細胞用于糖尿病治療取得了令人鼓舞的成果，但是仍有許多問題需要解決，如（1）干細胞轉(zhuǎn)分化過程中，除干細胞發(fā)育的微環(huán)境等因素外，控制干細胞高效定向分化為β細胞的關鍵調(diào)控因子仍不清楚；（2）干細胞體外誘導分化和體內(nèi)移植的安全性問題；（3）如何大規(guī)模用干細胞產(chǎn)生胰島素分泌細胞。隨著研究的進一步深入以及技術的提高和進步，相信不久的將來，這些問題都會被逐一解決，使干細胞臨床治療糖尿病成為可能。