鐘永亮，李 欣,1b,2，龐新躍，劉雪茹

(1.河南科技大學a.食品與生物工程學院；b.食品加工與安全國家級實驗教學示范中心；c.醫(yī)學技術與工程學院，河南 洛陽 471023; 2.河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

0 引言

間體膜囊是細菌在特殊環(huán)境下產(chǎn)生的一種由細胞質(zhì)膜內(nèi)褶而形成的囊狀膜構(gòu)造，參與細胞的多種生命活動[1-2]，如作為電子傳遞、磷酸化、氧化還原反應的發(fā)生位點[1, 3]，以及參與細胞分裂周期的DNA復制和分裂等[4-6]。眾多研究證實，菌體的損傷會誘導細胞形成間體膜囊[7-10]。當菌體在惡劣環(huán)境脅迫下，氧化磷酸化作用會增強，細胞膜流動性增強，從而內(nèi)褶形成間體膜囊，細胞的表面積增大，促進氧化反應，維持細胞代謝平衡[1]。不同抗生素損傷過的細菌均出現(xiàn)了間體膜囊，猜測細菌經(jīng)適當?shù)幕衔?、機械等損傷后也可能出現(xiàn)間體膜囊[2]。文獻[11-15]研究發(fā)現(xiàn)：在受損的菌體中均出現(xiàn)內(nèi)源過氧化氫(H2O2)的大量積累，且受損時形成的間體膜囊是這些內(nèi)源H2O2的主要積累位點。

丙二醛(maleic dialdebyde, MDA)是多不飽和酸過氧化的主要產(chǎn)物之一，其細胞毒性較為顯著。表現(xiàn)在機體內(nèi)部氧自由基對膜上的不飽和脂肪酸進行攻擊，伴隨著攻擊所衍生的脂質(zhì)過氧化物，能對細胞膜原有結(jié)構(gòu)造成損傷，進而導致細胞膜通透性的增高，在此基礎之上，細胞膜出現(xiàn)損傷，同時，功能以及相關代謝過程受到影響，甚至直接導致細胞死亡[21-25]。所以，測定細胞懸液的MDA濃度可間接反映細胞的損傷程度。慶大霉素(gentamicin, GM)屬于氨基糖類的廣譜抗生素，與細菌中的30S核糖體亞單位16rRNA解碼區(qū)的A部位發(fā)生直接作用，進而對蛋白質(zhì)的合成加以阻礙，使得翻譯異常或中斷，最終導致菌體破裂而亡[26-27]。

本文選擇慶大霉素對野生型大腸桿菌MG1655進行損傷處理，以電導率和MDA為損傷指標，對內(nèi)源H2O2進行組織化學染色后，通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察細菌損傷前后的變化情況，研究慶大霉素損傷處理對大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中所用的野生型大腸桿菌MG1655，由美國伊利諾伊大學微生物學院James A. Imlay教授惠贈，并采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基進行37 ℃活化與進一步培養(yǎng)。

氯化鈰(CeCl3，分析純)：英國Sigma公司；硫酸慶大霉素(美國藥典級)：上海生工生物公司；溶菌酶(分子生物學級，酶活≥20 000 U/mg)：上海生工生物公司；50%戊二醛溶液(質(zhì)量分數(shù)50%，化學純)：上海生工生物公司；微量MDA測試盒：南京建成生物工程研究所。

TGL-16型臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；雷磁DDS-307型電導率儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；日立F-4500型熒光分光光度計：深圳市昊光機電科技應用有限公司；TEM-100C型透射電子顯微鏡：日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 電導率檢測

將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用梯度質(zhì)量濃度的慶大霉素處理菌體后，6 000g室溫離心10 min，此時測定上清液電導率并記錄為σm。去除培養(yǎng)液中的上清液，將無菌水重懸菌沉淀，并靜置于室溫中5 min，此時測定菌懸液的電導率并記錄為σs，重復上述操作直至數(shù)據(jù)穩(wěn)定。根據(jù)記錄，將橫坐標定為σm，縱坐標定為σs，進行坐標軸的繪制，坐標圖中直線與橫坐標的相交點為細胞的電導率σp[28]。使用Origin軟件繪制菌體電導率和上清液的折線圖，橫坐標為不同終質(zhì)量濃度的慶大霉素，兩個縱坐標分別為σp和σs。

1.2.2 間體膜囊的外排和制備

將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，6 000g離心10 min收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌離心2次，去除上清液后加入原培養(yǎng)液1/10體積的Tris-HCl蔗糖高滲溶液重懸。室溫靜置90 min后，加入溶菌酶至終濃度為8.5 mol/L，37 ℃、80 r/min搖床處理30 min，再進行10 000g的離心，而后將含有間體膜囊的上清液輕輕吸出，將上清液置于4 ℃的環(huán)境中進行420 000g的離心，完成后靜置120 min。將上清液去除之后即可獲得間體膜囊沉淀，再通過適量的Tris-HCl緩沖液重懸間體膜囊，于-20 ℃存放備用[29]。

1.2.3 紫外光譜法和熒光光譜法測定H2O2濃度

利用H2O2在240 nm處有吸收峰的光譜特性[30-32]，采用紫外光譜法對慶大霉素作用后的細菌內(nèi)源H2O2濃度進行測定。按照文獻[33-34]的方法，通過熒光光譜法對間體膜囊外排過程中上清液的H2O2濃度進行測定。

1.2.4 組織化學染色法檢測H2O2濃度

參照文獻[35]的測定方式，使用CeCl3進行H2O2的特異染色。通過離心進行菌體的收集，用50 mmol/L CeCl3重懸菌體，在37 ℃預處理90 min，再用醋酸鈾和醋酸鉛實施樣品復染，借助TEM對鈰過氧化物的沉積物進行觀測。

1.2.5 硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid, TBA)比色法檢測MDA濃度

根據(jù)MDA測試盒相關要求，針對性地配制空白管、測定管、標準管和標準空白管，并用漩渦混勻器混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻至室溫，在可見光波長532 nm處，100 mm光徑，以蒸餾水為參比液，測各管吸光度值，按照測試盒說明書中的計算公式換算成MDA的濃度：

(1)

2 試驗結(jié)果

2.1 慶大霉素損傷對大腸桿菌細胞電導率的影響

菌懸液的電導率σs與細胞膜受損程度存在密切關系，外部環(huán)境中內(nèi)部電解質(zhì)釋放導致σs的變化[36]，σs越高，菌體損傷程度越嚴重。而σp是菌體顆粒的電導率，受菌體細胞壁上的羧基、磷酸鹽和胺基等電解質(zhì)類酸性基團分解的影響[37-38]，σp越低，說明菌體的損傷越嚴重。

圖1為慶大霉素損傷對大腸桿菌MG1655細胞電導率的影響。分析圖1可知： 雖然上清液電導率σs和菌體顆粒電導率σp變化無明顯規(guī)律，但兩者的變化趨勢相反。當慶大霉素終質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時，σs和σp差值最大，可確定為有效且最優(yōu)的損傷濃度。

2.2 紫外光譜法確定慶大霉素的最佳損傷時間

圖2為慶大霉素損傷后大腸桿菌內(nèi)源H2O2濃度隨時間的變化。吸光度反映H2O2的濃度，吸光度A240的值越高，說明H2O2的濃度越高。由圖2可知：隨著慶大霉素損傷時間延長，細胞內(nèi)源H2O2濃度呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢。在損傷時間為26 min時，內(nèi)源H2O2濃度趨于峰值并保持穩(wěn)定狀態(tài)，所以確定26 min是慶大霉素的最佳損傷時間。

圖1 慶大霉素損傷對大腸桿菌MG1655細胞電導率的影響

圖2 慶大霉素損傷后大腸桿菌內(nèi)源H2O2濃度隨時間的變化

2.3 慶大霉素損傷對大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響

圖3為慶大霉素損傷對大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響。對比圖3a和圖3b可知：慶大霉素損傷后，大腸桿菌周圍的H2O2沉積量顯著提升，并且間體膜囊數(shù)量增多。使用Image-Pro Plus7.0圖像軟件對菌體周圍積累的H2O2面積占細胞面積的比例進行二維分析，損傷處理前后的面積占比分別為1.85%和32.05%。圖3c和圖3d為慶大霉素損傷前后離體的間體膜囊，由圖3c和圖3d可知：經(jīng)慶大霉素損傷后，離體間體膜囊外周H2O2沉積顯著增加，離體間體膜囊外周H2O2面積與菌體面積之比由54.59%增加至87.45%。上述結(jié)果充分表明：慶大霉素所造成的損傷致使大腸桿菌內(nèi)源H2O2增加，并且間體膜囊聚集大量的H2O2。

(a) 慶大霉素損傷前的大腸桿菌

(b) 2.0 μg/mL慶大霉素損傷后的大腸桿菌

(c) 慶大霉素損傷前的離體間體膜囊

(d) 2.0 μg/mL慶大霉素損傷后的離體間體膜囊

圖3 慶大霉素損傷對大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響

2.4 間體膜囊外排過程中H2O2和電導率的變化

觀察圖3能夠發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌經(jīng)慶大霉素損傷處理，致使菌體和其間體膜囊的外周聚集大量的H2O2，間體膜囊外排。測定不同時段H2O2濃度和電導率的變化，可在一定程度上解析H2O2聚集在間體膜囊外周的時間段，以及間體膜囊與H2O2兩者間存在的聯(lián)系。

圖4為間體膜囊外排過程中上清液H2O2濃度和電導率變化。由圖4可知：通過Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理90 min之后，采用熒光光譜法測得間體膜囊外排過程中，上清液的H2O2濃度明顯增加，上清液的電導率下降；Tris-HCl蔗糖+溶菌酶處理相較于Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理的結(jié)果并沒有明顯區(qū)別。說明在Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理的90 min內(nèi)，菌體大量產(chǎn)生內(nèi)源H2O2，且在此期間細胞膜的損傷程度逐漸減弱。

圖4 間體膜囊外排過程中上清液H2O2濃度和電導率變化

2.5 內(nèi)源H2O2濃度對間體膜囊MDA濃度的影響

對圖4數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，菌體經(jīng)Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理后，其內(nèi)源H2O2的濃度大幅度提升，并且上清液電導率下降，側(cè)面說明隨著H2O2濃度的上升，細胞膜的損傷得到緩解。圖5為過氧化氫酶和慶大霉素處理對間體膜囊MDA濃度的影響。分析圖4和圖5的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過過氧化氫酶或慶大霉素或兩者共同處理，都能有效提高間體膜囊的MDA濃度。綜上分析，內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生和間體膜囊外排H2O2可能有利于減輕大腸桿菌的損傷，發(fā)揮一定的保護作用，但仍需進一步研究驗證。

圖5 過氧化氫酶和慶大霉素處理對間體膜囊MDA濃度的影響

3 討論

外排的間體膜囊外周聚集大量的H2O2，內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生和間體膜囊的外排似乎同時進行，并且隨著H2O2濃度的提升，細胞的損傷程度出現(xiàn)顯著性下降，說明內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生和間體膜囊外排H2O2可能有利于減輕大腸桿菌的抗損傷能力，但其保護機理需后續(xù)試驗驗證。慶大霉素的損傷和過氧化氫酶處理會使間體膜囊中的MDA濃度提升，而過氧化氫酶能有效清除H2O2，因此間體膜囊損傷程度與H2O2濃度呈相反的趨勢。進一步驗證間體膜囊周圍積累的H2O2濃度對間體膜囊具有保護作用，即伴隨間體膜囊外排產(chǎn)生的H2O2以及慶大霉素損傷條件下間體膜囊自身產(chǎn)生的H2O2都對間體膜囊具有保護作用。慶大霉素和過氧化氫酶處理的間體膜囊中的MDA濃度遠高于未經(jīng)慶大霉素處理的。經(jīng)慶大霉素損傷能使間體膜囊外周的H2O2積淀增加(H2O2濃度提升)，結(jié)合H2O2的保護作用，可說明慶大霉素和過氧化氫酶共同作用后的間體膜囊中MDA濃度增多，且損傷程度更嚴重。

大腸桿菌經(jīng)慶大霉素損傷之后，發(fā)現(xiàn)菌體和間體膜囊中H2O2積淀物數(shù)量顯著性提升，由此可知，間體膜囊可能是一種與正常細菌類似的內(nèi)源H2O2產(chǎn)生位點，而間體膜囊是否能產(chǎn)生大量的H2O2或間體膜囊是否能聚集胞內(nèi)H2O2并排到胞外，這些推測仍需后續(xù)試驗驗證。

目前，對于間體膜囊的形成及相關功能的研究尚未有結(jié)論，推測間體膜囊可能是一種特殊的電子傳遞通道[15]，但已有研究表明間體膜囊中含有參與氧化還原反應所需的氧化還原酶以及所有細胞色素，真核細胞的線粒體與間體膜囊兩者功能存在許多相同之處，由此可知間體膜囊與線粒體DNA之間的聯(lián)系是存在的[1, 3]，有相關研究指出間體膜囊是一種線粒體的等同物[1, 3]。但鑒于間體膜囊與線粒體兩者之間的結(jié)構(gòu)功能等存在一定差異性[1]，同時，針對線粒體內(nèi)含物的研究還存在許多不明之處，猜測間體膜囊可能是線粒體的一種內(nèi)含物，或是線粒體的一種衍生物。文獻[20]研究認為，間體膜囊具有重要的生物學功能，但是間體膜囊中的活性物質(zhì)尚不清楚。

本試驗研究結(jié)果證實了間體膜囊與H2O2之間的特殊關系，間體膜囊可能通過H2O2這一信號傳遞因子來完成更多的生理功能，而不僅僅只是損傷條件下的自我保護。對間體膜囊與H2O2的進一步研究將有助于更深入地了解間體膜囊。

4 結(jié)論

(1)使用非致死的慶大霉素損傷野生型大腸桿菌MG1655，損傷濃度與損傷程度并非呈正相關，且損傷期間細胞的內(nèi)源H2O2濃度隨時間的增長趨于穩(wěn)定。慶大霉素損傷的最佳終質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL，最佳損傷時間為26 min。

(2)慶大霉素損傷后的大腸桿菌外周以及離體間體膜囊外周H2O2的積淀量明顯增加。

(3)當大腸桿菌受到慶大霉素損傷時，大量內(nèi)源H2O2聚集在間體膜囊外周，且這些H2O2對間體膜囊具有保護作用。