郝婷 商麗紅 哈春芳

1寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院（銀川750001）；2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院婦科（銀川750004）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs，簡稱內(nèi)異癥）是指子宮內(nèi)膜（間質(zhì)或腺體）出現(xiàn)在宮腔以外的部位導致以慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕癥為主要癥狀的育齡婦女常見的婦科良性疾病[1]。雖然是良性疾病，但其浸潤周圍組織，甚至可以通過淋巴轉(zhuǎn)移至盆腔以外的組織，有很多腫瘤才有的遺傳學改變，高復發(fā)性，嚴重影響女性身心健康。目前該病發(fā)病機制仍不明確，研究顯示[2]EMs是一種子宮內(nèi)膜細胞活性增高所致的內(nèi)膜異常性基因病，與內(nèi)膜細胞的異地粘附、增殖及侵襲性增強有關。ERK1/2是MAPK 信息傳導通路中一個重要的因子，目前是MAPK 信號通路中研究最廣泛的，在細胞外活性因子調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各種酶促反應中發(fā)揮重要的作用，與細胞增殖與凋亡關系密切[3]。研究顯示[4]ERK1/2與正常子宮內(nèi)膜比較，在內(nèi)異癥中的在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞過度表達，并且磷酸化的水平也明顯增高，孕激素通過ERK1/2 刺激內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、抑制細胞凋亡，ERK1/2 能夠在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制中起著一定的作用，但其確切機制尚不十分清楚。腫瘤學研究顯示ERK通過Ras/Raf/MEK/ERK 通路介導腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，內(nèi)異癥中研究甚少。脂聯(lián)素分子受體3（progestin and adipoQ receptor，PAQR3）是脂連素受體家族的成員之一，最近被定性為負性調(diào)節(jié)Ras/Raf/MEK/ERK 信號傳導的空間調(diào)節(jié)因子級聯(lián)。近年來研究顯示[5]PAQR3在多種惡性腫瘤疾病中抑制ERK表達影響細胞增殖、侵襲及凋亡，進而促進疾病發(fā)生發(fā)展。但PAQR3在內(nèi)異癥中對于ERK的表達及細胞侵襲性的影響仍未有報道。本研究通過構建重組過表達PAQR3 慢病毒，探討其對于子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中ERK1/2表達及細胞侵襲性變化，為從機制上探尋EMs 新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料研究標本（子宮內(nèi)膜組織）均來源于2018年9月至2019年6月寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院在婦科行“腹腔鏡下卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫剝除術”，術中“刮宮術”獲取子宮在位內(nèi)膜組織，術后經(jīng)病理科診斷為“卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫”的子宮內(nèi)膜異位癥育齡期婦女患者10例（術前月經(jīng)周期規(guī)律，均處于分泌期子宮內(nèi)膜，半年內(nèi)無其他器官器質(zhì)性病變無內(nèi)科疾病，術前未接受激素藥物治療，宮腔無占位等病變），年齡20～40歲，平均（30.860±5.216）歲。該研究已通過“寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會”的批準授權，參加實驗及研究人員均已簽定知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng)術中獲取新鮮在位子宮內(nèi)膜組織放于液氮罐，快速轉(zhuǎn)運至細胞間，用PBS（磷酸鹽緩沖液）清洗3次，剪成約1 mm3大小的細小組織，加入含0.25%膠原酶IV（Gibio 17104-019）受熱消化吹打8 min，取上清液移入新離心管，含10%血清培養(yǎng)基終止消化，800 r/min 離心1 min，棄去上清，重新懸浮后加入培養(yǎng)皿中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液1次，細胞達到90%左右的融合進行細胞傳代及凍存。

1.2.2 細胞鑒定按照2 × 104/mL的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，6 h后觀察待細胞貼壁50%后，PBS清洗標本3次各1 min，4%多聚甲醛固定15 min；室溫干燥5 min；PBS 清洗3次各1 min，加入過氧化酶阻斷劑，置于37℃30 min；PBS清洗3次各1 min；加山羊血清，置于37℃30 min；一抗孵育（PBS配兔單克隆波形蛋白抗體1∶500；兔單克隆角蛋白1∶50；抗體均購自上海abcam公司；陰性對照用PBS），置于濕盒內(nèi)4℃過夜；PBS 清洗3次，各1 min；二抗（山羊抗兔單克隆抗體）濕盒37℃30 min 孵育；PBS 清洗3次，各1 min；加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，置于37℃30 min；PBS 清洗3次各1 min；DAB 顯色避光約3～10 min ；蒸餾水清洗2次，各1 min；蘇木素復染30 s；自來水清洗10 min；95%乙醇脫水1～2 s，樹膠封片顯微鏡下觀察。

1.2.3 重組慢病毒PAQR3轉(zhuǎn)染細胞病毒由北京合生生物科技公司設計構建合成，測定在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞MOI=50（72 h 轉(zhuǎn)染效率80%以上）為最佳轉(zhuǎn)染；以每皿3×105個細胞接種于6 cm2培養(yǎng)皿，晃動細胞皿使其均勻分布，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁30%～50%，無血清培養(yǎng)基換液，取MOI=50 作為最佳MOI 進行慢病毒轉(zhuǎn)染，3組細胞吹散均勻混合，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱8～12 h 后，繼續(xù)添加2 mL 含血清培養(yǎng)基后置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱，觀察細胞狀態(tài)必要時進行細胞換液，培養(yǎng)72 h 后觀察細胞熒光進行細胞傳代，以2 μg/mL 嘌呤霉素進行篩選陽性穩(wěn)定克隆株。

1.2.4 Western blot當子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞培養(yǎng)融合達70%以上時，用預冷PBS液沖洗3次，凱基蛋白提取試劑盒說明進行蛋白提取，用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度后，置于沸水中10 min 使其蛋白變性。用8% SDS-PAGE 分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗孵育4℃過夜，次日TBST 沖洗3遍各5 min，二抗室溫下晃蕩1 h，TBST 沖洗5遍各5 min，最后，置于BIO-RAD 成像儀，加入ECL 增強液反應1 min（1 mL A液+1 mL B液，混勻，覆蓋膜表面），最后根據(jù)曝光結果，運用Image J 計算光密度比值。

1.2.5 Transwell將Matrigel與無血清培養(yǎng)基按照1∶8 比例混合均勻，取Transwell 小室移入24 孔板中，每個小室上室內(nèi)加入100 μL 配置好Matrigel，避免底部接觸，37℃孵育過夜；取對數(shù)期生長間質(zhì)細胞，用0.25%的EDTA 胰酶將消化，加入無血清培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)1.5×104/mL，小室中加入細胞懸液200 μL（3 000個/孔）。下室中加入配置含20%血清的培養(yǎng)液500 μL，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，取出小室吸出培養(yǎng)液，PBS 沖洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS 沖洗3遍，棉簽蘸取多余水分，顯微鏡下每個小室選5個視野進行計數(shù)拍照，計算平均值，最后比較各組干預前后細胞穿膜數(shù)的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法每組實驗均重復3次以上，采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結果以（）表示，計量資料兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞鑒定原代培養(yǎng)、分離、純化在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。以波形蛋白陽性，角蛋白陰性作為間質(zhì)細胞鑒定標準。通過免疫細胞化學鑒定細胞，顯微鏡下觀察：波形蛋白組細胞大多呈梭形，染色呈棕黃色，細胞核明顯，提示波形蛋白染色陽性，而角蛋白組細胞也呈梭形表現(xiàn)，胞核明顯，但未見細胞染色，提示角蛋白染色陰性，PBS組細胞同角蛋白組，陰性表現(xiàn)，依據(jù)以上結果判定其為間質(zhì)細胞。每張細胞片取10個不同視野進行間質(zhì)細胞計數(shù)，細胞純度可達（93.00±0.17）%。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫細胞化學鑒定（×100）Fig.1 Immunocytochemical identification of endometrial stromal cells

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效果帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protien，GFP）的慢病毒Lv-PAQR3 及空載慢病毒，兩者均轉(zhuǎn)染內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，病毒組和空載組72 h 后GFP 下觀察陽性細胞布滿視野，表明轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察72 h 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染效果（×200）Fig.2 Effect of Lentiviral Transfection of Endometrial Stromal Cells in 72 h under an Inverted Fluorescence Microscope（×200）

2.3 3組細胞中PAQR3蛋白表達情況Western blot 檢測在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染前后PAQR3 蛋白表達情況，Lv-hPAQR3 干預后病毒組PAQR3 蛋白表達情況較空載組明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而空載組與空白組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、4 及表1。

表1 3組細胞中PAQR3 蛋白表達相對量Tab.1 The relative amount of PAQR3 protein expression in three groups of cells ±s

表1 3組細胞中PAQR3 蛋白表達相對量Tab.1 The relative amount of PAQR3 protein expression in three groups of cells ±s

注：*與空載組比較，P＜0.05

組別病毒組空載組空白組PAQR3表達量0.954±0.317*0.268±0.130 0.293±0.154 F 值9.668 P 值0.013

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞中PAQR3 蛋白表達結果Fig.3 PAQR3 protein expression in cells of each group after lentivirus transfection

2.4 3組細胞中ERK1/2 蛋白表達情況Western blot 檢測在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染前后ERK1/2 蛋白表達情況，Lv-hPAQR3 干預后病毒組ERK1/2 蛋白表達情況較空載組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而空載組與空白組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5、6 及表2。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞中PAQR3 蛋白表達影響Fig.4 Effect of PAQR3 protein expression in cells of various groups after lentivirus transfection

表2 3組細胞中ERK1/2 蛋白表達相對量Tab.2 The relative amount of ERK1/2 protein expression in three groups of cells±s

表2 3組細胞中ERK1/2 蛋白表達相對量Tab.2 The relative amount of ERK1/2 protein expression in three groups of cells±s

注：*與空載組比較，P＜0.05

組別病毒組空載組空白組ERK1/2表達量0.254±0.166*1.105±0.313 1.199±0.312 F 值10.926 P 值0.01

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞中ERK1/2 蛋白表達結果Fig.5 Expression of ERK1/2 protein in cells of each group after lentivirus transfection

2.5 3組細胞侵襲性變化情況Transwell 侵襲實驗檢測各個組細胞侵襲性變化結果，Lv-hPAQR3干預后病毒組細胞48 h 穿膜細胞數(shù)與空載組穿膜細胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空載組與空白組兩者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖7 及表3。

圖6 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞中ERK1/2 蛋白表達影響Fig.6 Effect of ERK1/2 protein Expression in cells of various group after lentivirus transfection

表3 過表達PAQR3 對3組在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞侵襲性的影響Tab.3 Effects of PAQR3 overexpression on invasiveness of eutopic endometrial stromal cells in three groups±s

表3 過表達PAQR3 對3組在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞侵襲性的影響Tab.3 Effects of PAQR3 overexpression on invasiveness of eutopic endometrial stromal cells in three groups±s

注：**與空載組比較，P＜0.01

組別病毒組空載組空白組細胞穿膜數(shù)（個）65.8±4.438**97.8±3.271 99.6±4.700 F 值103.92 P 值＜0.001

圖7 各組在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞48 h 侵襲效果（×400）Fig.7 48-hour invasion effect of eutopic endometrial stromal cells in each group（×400）

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥具有類似惡性腫瘤侵襲、遷移、血管生成以及凋亡等生物學特性，多條信號通路可能促進其發(fā)生發(fā)展。目前治療方式仍以手術及藥物治療為主[6]。病理特點包括局部浸潤生長、遠端移植、新生血管形成和術后高度復發(fā)[7]。目前EMs 發(fā)病機制仍然是妨礙疾病治療及預防的難點之一，研究顯示[8]解剖學因素、遺傳因素、內(nèi)環(huán)境、激素調(diào)節(jié)、免疫反應和氧化應激因子等都與EMs的發(fā)病機制相關。目前研究顯示[9]子宮內(nèi)膜異位癥中ERK1/2和MEK1/2表達上調(diào)，提示MAPK通路在子宮內(nèi)膜異位癥中過度活化。細胞從受到刺激至其出現(xiàn)相應生物學效應的改變過程中，MAPK 相應出現(xiàn)多級激酶的變化，而在這一過程中，ERK1/2 活化是將信號從細胞膜表面受體轉(zhuǎn)導至細胞核的關鍵，這一轉(zhuǎn)導過程有GTPase2Ras、Ras21和MEK 雙特異性激酶等上游元素參與，Ras/Raf/MEK/ERK 細胞信號傳遞通路中ERK1/2是重要的信號分子[10-13]。

課題組前期通過表達譜芯片技術分析EMs在位、異位內(nèi)膜中基因表達譜差異，發(fā)現(xiàn)MAPK、VEFG、PKC、Ras、ERK、NF-κB和PI3K 等因子顯著上調(diào)，各因子間具體調(diào)控機制不明確。前期研究已驗證子宮內(nèi)膜異位癥中ERK1/2 較正常內(nèi)膜呈高表達，需進一步明確ERK1/2 及其對EMs 細胞侵襲性作用機制。結合腫瘤學研究顯示ERK 通過Ras/Raf/MEK/ERK 通路介導腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，結合前期研究機制統(tǒng)一指向Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路。PAQR3 作為Ras/Raf/MEK/ERK 通路特異負性調(diào)節(jié)因子，本研究采用重組過表達PAQR3 慢病毒轉(zhuǎn)染EMs在位原代間質(zhì)細胞抑制Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路，運用Western blot 及Transwell實驗方法，結果顯示實驗組過表達PAQR3 后ERK1/2 蛋白表達較陰性對照組呈下降趨勢，且實驗組較陰性對照組細胞侵襲性明顯受抑制，陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義。說明在子宮內(nèi)膜異位癥中ERK 可能是通過Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路發(fā)揮作用，影響細胞侵襲性變化，進而促進子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展。

ERK1/2[14]是一種細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化激活發(fā)揮作用。ERK1/2[15]主要定位于胞質(zhì)，受細胞外炎性因子刺激并由其上游激酶MEK 激活，繼而入核發(fā)揮作用。Matsuzaki S 教授等研究表明在內(nèi)異癥及深部浸潤內(nèi)異癥患者上皮細胞和間質(zhì)細胞中ERK1/2表達及磷酸化程度較正常內(nèi)膜相比顯著增高[16]，提示ERK1/2 可能在子宮內(nèi)膜異位癥侵襲和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年研究[17]發(fā)現(xiàn)PAQR3 作為一種抑癌新基因在許多腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡變化過程中發(fā)揮重要作用。PAQR3是一種特異定位于高爾基體膜上的細胞器膜蛋白，PAQR3 已被認定為許多腫瘤的抑制因子，PAQR3 過度表達導致腫瘤細胞增殖、遷移、種植和血管生成[18-19]，其主要作用是將胞質(zhì)內(nèi)的B-Raf和C-Raf 激酶錨定在高爾基體上，造成Raf 激酶空間分布變化，干擾Raf 激酶與上游活化G 蛋白Ras-GTP 以及下游底物MEK 激酶的結合，阻斷和抑制其活化信號的傳遞，進而阻礙絲裂原信號Ras/Raf/MEK/ERK 通路的活化[20]，其在能量代謝，細胞凋亡，腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[21-22]。在人類白血病研究中其可通過抑制ERK表達進而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[23]。依據(jù)本實驗結果顯示子宮內(nèi)膜異位癥中過表達PAQR3 抑制Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路，可下調(diào)ERK1/2 蛋白表達并且抑制細胞侵襲性變化。這一發(fā)現(xiàn)是從機制和源頭上尋找內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的原因，進一步揭示復發(fā)的關鍵。

綜上所述，ERK1/2在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而該作用可能是通過Ras/Raf/MEK/ERK 通路調(diào)控，但具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步明確。EMs 作為一種多因素導致的基因混亂疾病，對于其研究仍任重道遠。