王秀華，武和英，楊 冰，張 琴，于黨輝，黃 倢

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室，山東青島 266071；2.廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣西北海 536000)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖用地的逐年減少和養(yǎng)殖用水資源的日益短缺，集約化高密度的養(yǎng)殖模式已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢。而在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，因殘餌、糞便分解導(dǎo)致的高濃度氨氮及亞硝基氮等有害物質(zhì)給養(yǎng)殖動物帶來了潛在的危害，如影響?zhàn)B殖動物正常的生理代謝[1]，破壞機(jī)體免疫力，加速病害發(fā)生[2]。因此研究降解養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝基氮的技術(shù)方法，將有助于促進(jìn)當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

本研究從山東德州市一羅非魚養(yǎng)殖場循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的脫氮池中分離到一株具有高效脫氮特性的細(xì)菌，研究了不同培養(yǎng)條件對其脫氮效果的影響，采用Biolog細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及16S rDNA序列比對方法對該菌進(jìn)行了初步的分類鑒定，同時對該菌進(jìn)行了生物安全性評價，以期為該菌的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源

菌株安全性評價用斑馬魚(daniorerio)300尾，購買于市場，平均體長(2.0±0.1)cm、平均體重(0.25±0.01)g。攻毒感染前，實驗室暫養(yǎng)2周。

1.1.2 脫氮培養(yǎng)基

氨氮培養(yǎng)基與亞硝酸鹽培養(yǎng)基配制方法參照文獻(xiàn)[6]，氨氮培養(yǎng)基(g/L)：丁二酸鈉 1.69；NH4Cl 0.08；MgSO4·7H2O 0.2；KH2PO40.05；Na2HPO40.5；NaCl 5.0；pH 6～7。亞硝酸鹽培養(yǎng)基(g/L)：丁二酸鈉 1.69；NaNO20.1；MgSO4·7H2O 0.2；KH2PO40.05；Na2HPO40.5；NaCl 5.0；pH 6～7。配制氨氮培養(yǎng)基、亞硝酸鹽培養(yǎng)基，分別先配制不含有NH4Cl、NaNO2的基礎(chǔ)成分?；A(chǔ)成分配制完畢后，各培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min，之后將經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌的一定濃度的NH4Cl、NaNO2母液，按相應(yīng)的比例加入到滅菌后的培養(yǎng)基中。在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂則為固體培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的采集和分離純化

從山東省德州市一羅非魚養(yǎng)殖場循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的脫氮池和山東省濰坊市一內(nèi)陸對蝦養(yǎng)殖場的半咸水對蝦養(yǎng)殖池中分別采集水樣，置入無菌采樣瓶，低溫條件下帶回實驗室，用LB平板劃線分離純化(LB培養(yǎng)基：蛋白胨 1%；酵母提取物 0.5%；NaCl 1%)，對不同的菌株編號入菌種資源庫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脫氮菌株的篩選

1.2.3 脫氮菌株碳源的篩選

1.2.4 菌株在不同鹽度中的脫氮效果

1.2.5 菌株在不同pH中的脫氮效果

1.2.6 菌株在不同C ∶N比中的脫氮效果

1.2.7 菌株在硝化和亞硝化培養(yǎng)基中的生長曲線及對應(yīng)的脫氮效果

1.2.9 菌株安全性實驗評價

用LB液體培養(yǎng)基將待測菌株28 ℃活化24 h后，4 ℃ 4 000g離心15 min，沉淀用PBS稀釋成菌懸液，并用曝氣48 h后的自來水將菌懸液分別稀釋成2×104、2×105、2×106、2×107、2×108CFU/mL五個濃度梯度的菌液，用于浸泡感染實驗，空白組加入10%的PBS。實驗用水族箱每個有效水體5 L，每組放入斑馬魚40尾，每組設(shè)置兩個平行。

感染用斑馬魚實驗前停喂餌料24 h，置入菌液后24 h恢復(fù)正常投喂管理，每天進(jìn)行吸污和換水，日換水量為30%。每天早晚2次觀察并記錄每組斑馬魚的死亡情況，直到一周之內(nèi)不再死亡即停止觀察，然后統(tǒng)計累計死亡率。

1.2.10 菌株鑒定

16S rDNA序列分析比對及系統(tǒng)發(fā)育分析法：細(xì)菌DNA提取采用細(xì)菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[8]。擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行分析，所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行同源性比對，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.0 進(jìn)行多重比較后通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定分離菌株的分類地位。

Biolog細(xì)菌鑒定：采用Biolog微生物自動分析系統(tǒng)(MICROSTATION，Biolog，美國)，細(xì)菌純培養(yǎng)采用Biolog BUG 的固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，再將菌落用液體培養(yǎng)基(IF-B)稀釋(Biolog，美國)，稀釋的菌液加入到Gen III 微板中(每個孔100 μL)，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后用MICROSTATION進(jìn)行鑒定。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差(x±s，n=3)的方法來表示，運用軟件SPSS18.0，經(jīng)One-Way ANOVA 分析，采用Duncan’s多重檢驗分析試驗結(jié)果平均數(shù)的差異顯著性，設(shè)差異水平α=0.05 (P<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫氮菌株的篩選

從羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)和對蝦養(yǎng)殖池中共分離出13株菌株，其中有6個菌株既能在硝化培養(yǎng)基中生長也能在亞硝酸鹽培養(yǎng)基中生長，結(jié)果見表1。選取去氨氮效果最佳的菌株DZYC2016100902(簡稱DZYC02菌株)為本實驗的目的菌株用于后續(xù)研究，該菌株在硝化培養(yǎng)基及亞硝酸鹽培養(yǎng)基中菌落呈白色、圓形、邊緣整齊，菌落1 mm左右，在LB培養(yǎng)基中為乳白色，圓形、邊緣整齊，菌落2 mm左右，表面濕潤有光澤。

表1 不同菌株對氨氮的去除率Tab.1 Removal rates of ammonia nitrogen by different bacterial strains %

2.2 碳源對菌株DZYC02脫氮效果的影響

菌株DZYC02在不同碳源條件下對氨氮的去除率如圖1所示。可知菌株在不同的碳源中48 h對氨氮的去除率由低到到高的碳源排列是丁二酸鈉、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、檸檬酸鈉。以檸檬酸鈉為碳源時，在24 h和48 h的氨氮去除率均達(dá)到100%，均顯著高于其它組的氨氮去除率，其它組48 h氨氮去除率也明顯高于24 h；當(dāng)丁二酸鈉為碳源時，24 h和48 h氨氮去除率均低于其他組，差異顯著；當(dāng)乙酸鈉為碳源時，24 h氨氮去除率低于葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉組，差異顯著，但以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為唯一碳源時氨氮去除率差異不顯著；而乙酸鈉組48 h氨氮去除率高于葡萄糖、蔗糖組，差異顯著，也高于可溶性淀粉組，差異不顯著。說明碳源種類差異影響菌株DZYC02氨氮的去除率。

2.3 鹽度、pH及C ∶N對菌株DZYC02脫氮效果的影響

不同鹽度、pH及C ∶N環(huán)境中菌株DZYC02脫氨氮效果見圖2。由實驗結(jié)果可知，當(dāng)鹽度由0升

圖1 不同碳源對菌株氨氮去除率的影響Fig.1 Effects of carbon sources on ammonia nitrogen removal rates of strain DZYC02 標(biāo)有不同小寫字者表示24 h時組間差異顯著;標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著；標(biāo)有不同*者表示48 h時組間差異顯著;標(biāo)有相同*者表示組間差異不顯著

高到15時，發(fā)酵液中氨氮的去除率一直保持100%；當(dāng)鹽度大于15時，該菌株的脫氮能力開始下降，脫氮率隨著鹽度的升高而降低，當(dāng)鹽度為30時，該菌株的脫氮率趨于0。

當(dāng)pH值由4升高到5時，菌株氨氮去除率由(3.2±1.2)%升到的100%。當(dāng)pH處于5～7時，氨氮去除率維持在(99.9±0.1)%，該pH范圍內(nèi)3個組間的脫氨氮效果差異不顯著；當(dāng)pH值由7升高到9時，菌株發(fā)酵液中氨氮的去除率顯著下降，脫氮率由(99.8±0.1)%下降到(2.9±0.6)%。表明pH是影響該菌株脫氨氮效果的因子之一，該菌適宜于弱酸環(huán)境。

當(dāng)C ∶N由5提高至15時，發(fā)酵液中氨氮的去除率隨C ∶N的升高而顯著增大；當(dāng)C ∶N在15～30時，各組氨氮去除率均在100%，趨于穩(wěn)定。

圖2 鹽度、pH及C ∶N對菌株DZYC02脫氮效果的影響Fig.2 Effects of salinity，pH and C ∶N on ammonia nitrogen removal rates of strain DZYC02

2.4 菌株在氨氮及亞硝酸鹽培養(yǎng)基中的生長曲線

菌株DZYC02在氨氮及亞硝酸鹽液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖3。在硝化培養(yǎng)基中，菌株DZYC02在經(jīng)3 h左右的遲緩期后，進(jìn)入對數(shù)生長期，又經(jīng)12 h后菌液OD600 nm值增長趨于平緩，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。在細(xì)菌對數(shù)生長期，培養(yǎng)液中的氨氮濃度快速降低，表明細(xì)菌增殖過程中可利用培養(yǎng)基中的氨氮。

菌株DZYC02在亞硝氮液體培養(yǎng)基中，經(jīng)12 h左右的遲緩期后，進(jìn)入對數(shù)生長期；21 h左右又經(jīng)一次遲緩增殖，到36 h菌株又開始進(jìn)入對數(shù)生長期，到42 h發(fā)酵液OD600 nm值達(dá)到最大，隨后進(jìn)入下降趨勢；39 h以后培養(yǎng)基中的亞硝氮濃度仍逐漸降低，至48 h亞硝基氮濃度接近為零，表明細(xì)菌增殖過程中可利用培養(yǎng)基中的亞硝基氮。

圖3 菌株在氨氮及亞硝氮培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 The growth curve of strain DZYC02 in ammonia nitrogen and nitrate nitrogen medium

2.6 菌株的生物安全性

結(jié)果顯示，斑馬魚經(jīng)菌株DZYC02浸泡感染兩周時間內(nèi)，高濃度實驗組(2.0×108CFU/mL)和低濃度實驗組(2.0×104CFU/mL)及對照組(PBS)的斑馬魚，均未出現(xiàn)死亡，并且在此期間斑馬魚正常攝食，游動活潑。而僅在2.0×105CFU/mL濃度組出現(xiàn)1尾死亡。根據(jù)實驗結(jié)果綜合判斷，該菌株對斑馬魚不具有感染力。

2.7 菌株鑒定

PCR擴(kuò)增菌株DZYC02的16S rDNA序列，PCR電泳圖見圖4，將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，得1 377 bp的堿基序列(NCBI 登錄號為SUB5864511)，提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對)，發(fā)現(xiàn)該菌與肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99%。選取與該菌源性相近的16株菌的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5，可見該菌與K.pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis ATCC 13884菌聚為一類，初步判定該菌為一株克雷伯氏菌K.pneumoniae。Biolog鑒定結(jié)果顯示菌株DZYC02與K.pneumoniae的相似度達(dá)到 0.615，大于0.5，遺傳距離3.977，小于5。綜合兩種鑒定結(jié)果，判定該菌株為一株肺炎克雷伯桿菌。

圖4 菌株DZYC02的16S rDNA 電泳圖Fig.4 PCR products of 16S rDNA gene of bacterial strains DZYC02

3 討論

利用生物脫氮技術(shù)進(jìn)行水質(zhì)處理已較早用于污水處理行業(yè)，近年來生物脫氮技術(shù)也被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[9,10]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的脫氮菌種類多，根據(jù)其同化作用類型，分為自養(yǎng)硝化細(xì)菌、異養(yǎng)硝化細(xì)菌[11,12]、自養(yǎng)反硝化細(xì)菌、異養(yǎng)反硝化細(xì)菌[13,14 ]。而有些脫氮菌兼具有硝化與反硝化能力[12,15 ]，如肺炎克雷伯氏菌為異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌[16]，常見于污水處理系統(tǒng)中，其脫氮特性與攜帶的編碼羥胺氧化酶、周質(zhì)硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶的基因表達(dá)有關(guān)[17,18]。有研究表明，異養(yǎng)硝化菌在氨代謝過程中，由氨單氧酶催化氨形成羥胺后，經(jīng)非血紅素鐵羥胺氧化酶的催化，直接形成N2O及N2[19]，而不同于自養(yǎng)硝化細(xì)菌，在氨氧化過程中產(chǎn)生亞硝基氮。

圖5 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株DZYC02與相近的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree base on 16S rDNA sequences generated of strain DZYC02 with other similar stains節(jié)點數(shù)表示bootstrap支持率，1 000次重復(fù).

微生物脫氮過程與環(huán)境理化因子及營養(yǎng)物質(zhì)密切相關(guān)，不同的脫氮菌對環(huán)境及營養(yǎng)的需求差異較大，適宜的鹽度、溫度、pH、溶解氧及C ∶N等能夠提高脫氮效果[20-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，從養(yǎng)殖場沉積淤泥中分離的產(chǎn)酸克雷伯菌(K.oxytoca)適宜最佳脫氮條件為pH 7～9，鹽度0～5，當(dāng)鹽度大于15時不具脫氮效果[25]，且采用不同的碳源，其脫氮效果存在差異。本研究中所分離的菌株DZYC02為一羅非魚循環(huán)水養(yǎng)殖池中的菌株，在中性至偏弱酸(pH 5～7)低鹽度(0～15)環(huán)境中對氨氮及亞硝基氮具有良好的去除作用，環(huán)境中添加適量的碳源可提高該菌的脫氮效果?？芍瑸橐粚俚膬芍昃蛏娴沫h(huán)境不同，其脫氮條件存在一定的差異。

肺炎克雷伯氏菌屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，該菌廣泛分布在自然界，因含有多種毒力因子[26]，對人畜均具有致病力[27,28]。肺炎克雷伯氏菌能夠引起團(tuán)頭魴(Megalobramaamhlycephala)出血性敗血癥[29]，該菌也可從海水魚中分離到[30]。 感染實驗初步證實，本研究中所分離的肺炎克雷伯氏菌為一無毒株，浸泡感染斑馬魚不具有毒力，而在分離該菌的羅非魚循環(huán)養(yǎng)殖池中，也未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖羅非魚出現(xiàn)發(fā)病的現(xiàn)象，但為了養(yǎng)殖動物的安全，在開發(fā)應(yīng)用該菌前，還需要對該菌對魚類的侵染力、毒力等相關(guān)因子開展進(jìn)一步的研究。