孟宏杰 陳銳 唐培安 陸月明 趙葉飛 馮俊

摘要 為探明臭氧對主要儲糧害蟲的熏蒸效果及其與磷化氫抗性的關(guān)系，本研究采用臭氧發(fā)生裝置測定濃度為 0.84 g/m3臭氧對 5 種主要儲糧害蟲（赤擬谷盜、雜擬谷盜、玉米象、銹赤扁谷盜、谷蠹）的熏蒸效果，及對具有不同磷化氫抗性的赤擬谷盜（抗性系數(shù)為1.7～862.7）和雜擬谷盜（抗性系數(shù)為2.3～144.7）的毒力效果，并統(tǒng)計(jì)分析了試蟲經(jīng)臭氧熏蒸 1 h 后在不同時間內(nèi)的行為狀態(tài)差異。研究結(jié)果表明：在 0.84 g/m3臭氧濃度下，5 種害蟲對臭氧均具有較強(qiáng)敏感性，其 LT50在0.58～1.53 h，其中谷蠹對臭氧的耐受性相對最強(qiáng);赤擬谷盜和雜擬谷盜的不同磷化氫抗性品系對臭氧的敏感性差異較小，表明磷化氫與臭氧無交互抗性。經(jīng)臭氧熏蒸1 h后，試蟲有正常爬行、非正常爬行和死亡3種行為狀態(tài)，其中較大比例的試蟲（24%～66%）處于非正常爬行狀態(tài)，且持續(xù)時間較長，約10 d后此部分試蟲恢復(fù)正?；蛩劳觥＝Y(jié)果表明，臭氧對儲糧害蟲具有高效性和廣譜性，且與磷化氫無交互抗性，可作為儲糧害蟲防治及磷化氫抗性治理藥劑。

關(guān)鍵詞 儲糧害蟲; 熏蒸劑; 臭氧; 磷化氫抗性; 死亡率

中圖分類號： S 379.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019136

Efficacy of ozone against stored grain insects with different resistance to phosphine

MENG Hongjie1， CHEN Rui1， TANG Peian1， LU Yueming2， ZHAO Yefei3， FENG Jun3

（1. College of Food Science and Engineering， Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety，

Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing 210023， China; 2. Taicang Grain Bureau of Jiangsu Province，

Taicang 215400， China; 3. Taicang Grain Marketing Limited Company of Jiangsu Province， Taicang 215400， China）

Abstract

In order to investigate the efficacy of ozone against major stored-product insects and its relationship with phosphine-resistance， five stored-product insects， Tribolium castaneum （Herbst）， T.confusum （Jac. du Val.）， Sitophilus zeamais （Motschulsky）， Cryptolestes ferrugineus （Stephens） and Rhyzopertha dominica （Fabricius） were exposed to ozone at concentration of 0.84 g/m3 by using an ozone generator. The toxicity of ozone to T.castaneum （Rf 1.7862.7） and T.confusum （Rf 2.3144.7） with different phosphine-resistance were studied. Finally， the differences of behavioral state of the insects in different observation time after ozone fumigation for 1 h were evaluated. The results indicated that the five pests were sensitive to ozone， and their LT50 ranged from 0.58 h to 1.53 h， of which R.dominica was the most resistant to ozone at tested concentration. There is no significant difference in the sensitivity to ozone among different phosphine-resistant strains of T.castaneum and T.confusum and there is no cross-resistance between the resistance to phosphine and ozone. After being fumigated by ozone for 1 h， the insects showed three behavioral states， including normal crawling， abnormal crawling and death. A large proportion of the test insects （24%66%） were in an abnormal crawling state and lasted for a long time. After about 10 days， the part of the test insects returned to normal or died. The results showed that ozone fumigation is highly efficient and broad-spectrum for stored-product insects， and there is no cross-resistance between the resistance to phosphine and ozone. Ozone has the characteristics of controlling stored grain pests and phosphine-resistance treatment.

Key words

stored grain insect; fumigant; ozone; phosphine-resistance; mortality

目前，國內(nèi)儲糧害蟲的防治主要采用磷化氫（PH3）熏蒸或有機(jī)磷酸鹽（馬拉硫磷、殺螟松、甲基嘧啶磷等）和擬除蟲菊酯殺蟲劑噴灑拌糧等方式[1]。其中，PH3在儲糧害蟲防治中扮演著極為重要的角色。然而，長期單一使用PH3已導(dǎo)致世界范圍內(nèi)主要儲糧害蟲（赤擬谷盜Tribolium castaneum、谷蠹Rhyzopertha dominica、銹赤扁谷盜Cryptolestes ferrugineus等）對PH3產(chǎn)生了十分嚴(yán)重的抗藥性，因而用藥量不斷增加，給生態(tài)環(huán)境帶來較大壓力，糧食安全及人畜安全也受到嚴(yán)重威脅。PH3的應(yīng)用面臨新的挑戰(zhàn)，尋找合適的替代PH3的熏蒸劑成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[2]。

臭氧（O3）是一種強(qiáng)氧化劑，在空氣中極易被分解為氧氣。臭氧具有廣譜、高效的殺菌特性和對微小害蟲的殺滅作用。相對于其他殺蟲劑，臭氧無殘留，殺菌快速，且在一定程度上能降解糧食表面殘留的有機(jī)磷、有機(jī)氯等農(nóng)藥，是一種環(huán)保、優(yōu)良的殺蟲劑替代品[35]。已有研究表明，臭氧對儲糧害蟲的呼吸作用等生理功能具有一定的影響，并且能在一定條件下殺死不同蟲態(tài)的昆蟲[612]。陳渠玲等[13]通過模擬試驗(yàn)證明臭氧對高水分糧具有良好的防霉效果，對油脂中黃曲霉毒素B1具有較好的降解功能。因此，臭氧儲糧技術(shù)在糧食儲藏領(lǐng)域?qū)玫皆絹碓綇V泛的關(guān)注和研究。本文主要研究臭氧對主要儲糧害蟲的毒力，并深入分析不同PH3抗性品系的害蟲對臭氧的敏感性差異及臭氧熏蒸后昆蟲的行為狀態(tài)變化情況。在實(shí)驗(yàn)室條件下，驗(yàn)證臭氧儲糧技術(shù)對高抗性儲糧害蟲的有效性及其適用條件，為研發(fā)高效合理的儲糧害蟲治理新技術(shù)提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx采自湖南、廣東、重慶、?？?、蘇州等全國不同省市地區(qū)，并已在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院儲糧害蟲實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)數(shù)10代（培養(yǎng)期間無任何藥劑接觸），具體情況見表1。試蟲的磷化氫抗性系數(shù)的測定采用聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）推薦的方法。將試蟲置于熏蒸瓶，在30℃、相對濕度75%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中密閉熏蒸20 h，熏蒸結(jié)束散氣1 h后取出試蟲，置于添加飼料的培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)3 d后統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量，記錄每個濃度下試蟲的死亡數(shù)與總數(shù)，并計(jì)算其抗性系數(shù)?？剐韵禂?shù)（Rf）=試蟲實(shí)際LC50/敏感品系LC50。敏感品系半致死濃度以FAO的推薦值及抗性抽查情況為依據(jù)（赤擬谷盜和雜擬谷盜的LC50分別為0.009、0.011 mg/L）。本試驗(yàn)赤擬谷盜品系CKTca的PH3抗性系數(shù)源于王亞洲等[14]的報(bào)道，其余試蟲抗性系數(shù)由本實(shí)驗(yàn)室測定但尚未發(fā)表。

1.1.2 儀器與試劑

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BSC-250），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DUG-9642A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DH45S 臭氧發(fā)生器，南京金環(huán)仁寶科技有限公司;GT-903 復(fù)合氣體檢測儀，深圳市科爾諾電子科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 飼料準(zhǔn)備

玉米象飼料：將小麥用水清洗干凈，放入60℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干4 h，調(diào)節(jié)小麥水分含量至15%±1%，冷卻后放入4℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

銹赤扁谷盜、赤擬谷盜、雜擬谷盜飼料：將上述小麥磨碎，得到全麥粉，冷卻后放入冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

谷蠹飼料：使用時將上述小麥籽粒與全麥粉按2∶1混合均勻備用。

1.2.2 試蟲培養(yǎng)

每種試蟲挑選數(shù)百頭成蟲（無性別區(qū)分）置于裝有半瓶飼料的500 mL廣口瓶中，于溫度30℃±0.5℃，相對濕度75%，無光照條件下飼養(yǎng)。待成蟲產(chǎn)卵3 d后，挑出全部成蟲，并將帶有卵的飼料在相同條件下進(jìn)一步培養(yǎng)（3 d 產(chǎn)的卵視為同一齡期），待其羽化為成蟲后，挑選2～3 周齡、生長狀態(tài)良好的成蟲進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 臭氧對不同儲糧害蟲的毒力測定

臭氧熏蒸裝置：具塞廣口熏蒸瓶，雙向?qū)Ч芊謩e連接臭氧發(fā)生器和復(fù)合氣體檢測儀，保證氣密性良好。將試蟲放入瓶中（不添加飼料）進(jìn)行毒力測定。環(huán)境溫度25℃±1℃，相對濕度為60%±2%，臭氧流速為3 L/min，熏蒸瓶中臭氧濃度為0.84 g/m3。

選用5種儲糧害蟲作為試驗(yàn)對象，分別為赤擬谷盜（QHTca）、雜擬谷盜（FXTco）、谷蠹（SMRd）、銹赤扁谷盜（WLCf）和玉米象（CDSz）。挑取2～3周齡的成蟲50頭（無性別區(qū)分），待熏蒸瓶中臭氧濃度達(dá)到設(shè)定值并且穩(wěn)定后，迅速將試蟲放入瓶中。熏蒸時間分別為30、60、90、120、150、180 min，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以未經(jīng)臭氧處理的試蟲為空白對照。熏蒸結(jié)束后散氣并將試蟲置于添加適量飼料的培養(yǎng)皿中，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（30℃±0.5℃，相對濕度75%，無光照）中培養(yǎng)，10 d后統(tǒng)計(jì)死亡蟲數(shù)（試蟲無生理活動者視為死亡）。

1.2.4 臭氧對不同磷化氫抗性的赤擬谷盜、雜擬谷盜品系的毒力測定

選取具有不同PH3抗性的6個赤擬谷盜品系（XKTca、TLTca、CKTca、HKTca、QHTca、SZTca）和3個雜擬谷盜品系（FXTco、ZYTco、GZTco）作為試驗(yàn)對象，試驗(yàn)方法同 1.2.3。經(jīng)臭氧熏蒸1 h的試蟲在培養(yǎng)期間每隔24 h 觀察統(tǒng)計(jì)其行為狀態(tài)并分別計(jì)算不同行為狀態(tài)試蟲所占比率。正常爬行者視為正常爬行狀態(tài);四肢觸角可以活動，但不能爬行者視為非正常爬行狀態(tài);四肢觸角不活動，無生理活動者視為死亡狀態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 17.0 軟件分析測定結(jié)果，計(jì)算各種昆蟲，各個品系的LT50、LT99和相應(yīng)的毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧對不同儲糧害蟲的毒力

臭氧對不同儲糧害蟲的毒力測定結(jié)果見表2。由表2可知，赤擬谷盜、雜擬谷盜、玉米象、銹赤扁谷盜、谷蠹對臭氧均具有較強(qiáng)的敏感性，其LT50為0.58～1.53 h，其中銹赤扁谷盜對臭氧的敏感性最強(qiáng)，LT50為0.58 h;LT99在2.85～5.98 h，其中谷蠹對臭氧的耐受性相對最強(qiáng)，LT99為5.98 h。銹赤扁谷盜和谷蠹的毒力回歸曲線斜率都較小，說明這兩種昆蟲的種群差異性較大，對臭氧的耐受性不同。

2.2 臭氧對赤擬谷盜、雜擬谷盜不同磷化氫抗性品系的毒力

由表 1可知，赤擬谷盜6 個品系對磷化氫抗性系數(shù)相差巨大（Rf為1.7～862.7），但對臭氧的敏感性（表3）差異不大（LT50為1.12～1.34 h）;雜擬谷盜不同磷化氫抗性品系（Rf為2.3～144.7）對臭氧的敏感性略有差異（LT50為1.08～1.53 h），但與磷化氫抗性無相關(guān)性，表明臭氧與磷化氫之間無交互抗性。除個別品系外，多數(shù)品系的毒力回歸曲線斜率相似（k為 12.11～14.97），表明害蟲對臭氧的反應(yīng)具有相對齊性。

2.3 赤擬谷盜和雜擬谷盜不同品系經(jīng)臭氧熏蒸1 h后的行為狀態(tài)變化

赤擬谷盜和雜擬谷盜經(jīng)臭氧熏蒸1 h后表現(xiàn)出正常爬行、非正常爬行和死亡3種行為狀態(tài)，其中，第1天試蟲的行為狀態(tài)分化最為明顯，正常爬行的試蟲占26%～72%;死亡的試蟲占4%～22%;非正常爬行的試蟲占24%～66%，且持續(xù)時間長（10 d）（圖 1），10 d后無試蟲處于非正常爬行狀態(tài)。非正常爬行的試蟲飼養(yǎng)10 d后，多數(shù)趨于正常爬行，正常爬行的試蟲比例相比第1天增加16%～60%，而死亡比例相比第1天增加6%～24%（表4），說明不同試蟲對臭氧的耐受力及其恢復(fù)能力有差異，需要延長觀察期（至少10 d）才能得到其準(zhǔn)確的死亡率。

3 討論

長期以來，PH3 因其在糧堆中的穿透性強(qiáng)、殺蟲譜廣、成本較低、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，在糧食儲藏過程中得到廣泛應(yīng)用。然而長期單一使用PH3使害蟲產(chǎn)生了極大的抗性，導(dǎo)致用藥量增加，對環(huán)境、人畜都造成巨大危害。因此，研究人員不斷探索尋求PH3的替代熏蒸劑，在這個過程中，氣調(diào)貯藏（N2和CO2）、植物精油殺蟲和硅藻土殺蟲技術(shù)得到一定的研究與應(yīng)用[15]。另外，低溫和熱處理已經(jīng)被證明在一定條件下可以有效殺滅具有不同磷化氫抗性的儲糧害蟲[1617]。臭氧熏蒸能夠較為徹底地殺死糧食中的害蟲及霉菌，并且在糧食和環(huán)境中無殘留，無二次污染，且成本較低，是未來實(shí)現(xiàn)綠色儲糧的重要途徑之一。但臭氧極易分解，且具有吸附性，需要配合有效的通風(fēng)系統(tǒng)對糧食進(jìn)行綜合處理，因此，臭氧的密閉環(huán)流熏蒸及其分解消耗速率仍需深入研究[1819]，臭氧殺蟲滅菌技術(shù)在實(shí)倉中的廣泛應(yīng)用仍需要進(jìn)一步的探索。

本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下，測定了臭氧對赤擬谷盜、雜擬谷盜、玉米象、銹赤扁谷盜、谷蠹的毒力，發(fā)現(xiàn)在0.84 g/m3的臭氧環(huán)境下，上述害蟲在熏蒸5.98 h后均能被全部殺死，且不同蟲種間敏感性差異較大，其中谷蠹對臭氧的耐受性最強(qiáng)（LT99為5.98 h）。有研究人員分析了臭氧對不同昆蟲的毒性，發(fā)現(xiàn)谷蠹比雜擬谷盜、赤擬谷盜對臭氧的敏感性更強(qiáng)[79]，與本文的研究結(jié)果不同，這可能是由于不同地理種群的差異決定的。此外，臭氧對不同PH3抗性品系害蟲的毒力測定結(jié)果表明，不同抗性品系的試蟲對臭氧的敏感性差異較小，昆蟲在對PH3抗性與臭氧耐受性方面沒有明顯的相關(guān)性，二者無交互抗性。E等[20]和Sousa等[21]的研究也得到了類似的結(jié)論。Athanassiou等[2223]研究了赤擬谷盜、雜擬谷盜、谷蠹等儲糧害蟲經(jīng)PH3熏蒸不同時間后的行為反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)試蟲存在活躍、緩慢移動和不移動3種行為狀態(tài)（或正常爬行和擊倒兩種狀態(tài)），PH3 抗性品系昆蟲相比敏感品系具有更強(qiáng)的耐受力與恢復(fù)力。臭氧熏蒸后同樣存在正常爬行、非正常爬行和死亡3種行為狀態(tài)，其中，熏蒸1 h后非正常爬行狀態(tài)的試蟲比例達(dá)24%～66%，且非正常爬行狀態(tài)持續(xù)時間較長，一般在散氣10 d后非正常爬行狀態(tài)才完全消失，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，非正常爬行狀態(tài)的試蟲小部分徹底死亡（6%～24%），另一部分則恢復(fù)到正常爬行狀態(tài)（16%～60%）。此種現(xiàn)象表明，臭氧熏蒸試驗(yàn)散氣后需要較長時間的觀察期（至少10 d）才能得到準(zhǔn)確的死亡率。此外，非正常爬行狀態(tài)的害蟲對其他藥劑的敏感性可能較強(qiáng)，因此，將臭氧與其他藥劑聯(lián)合使用有可能會得到較好的控制效果，這有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下測定了一定濃度的臭氧對5種主要儲糧害蟲的毒力;并深入分析了赤擬谷盜和雜擬谷盜這兩種害蟲對臭氧耐受性及PH3抗性的相關(guān)性;評估了臭氧熏蒸后昆蟲的行為狀態(tài)及其恢復(fù)能力的差異;驗(yàn)證了臭氧熏蒸對儲糧害蟲的高效性和廣譜性，表明臭氧與磷化氫無交互抗性，可用于儲糧害蟲防治及磷化氫抗性治理。本研究也為儲糧害蟲防治新技術(shù)的研發(fā)及PH3抗性問題的解決提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和基本策略。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190319?? 修訂日期： 20190604

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0401004-04，2017YFD0401003-5）;江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（17KJB210005）;江蘇省六大人才高峰高層次人才項(xiàng)目（NY-057）;糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201413007-2，201513002-5-3）;江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程;江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX18_1421）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者E-mail：tangpeian@163.com

#為并列第一作者