梅原，薛洋，于昊，姜志洋，申軍士，茆達(dá)干

(動(dòng)物科學(xué)類國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

蛋白質(zhì)是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)水平的主要限制因素，但富含蛋白質(zhì)的豆科牧草卻不能被廣泛的種植，蛋白質(zhì)飼料又通常非常昂貴，不適合用于大規(guī)模飼養(yǎng)生產(chǎn)，設(shè)計(jì)低蛋白日糧不僅能夠有效降低飼料成本，也能減少排泄物中氮對(duì)環(huán)境的污染。據(jù)估計(jì)，到2020年我國(guó)蛋白飼料缺口將達(dá)到4 800萬(wàn)噸，蛋白質(zhì)飼料資源的缺乏促使人們?cè)谏a(chǎn)中尋找新型蛋白質(zhì)原料，而眾多研究表明，非蛋白氮(non-protein nitrogen)飼料原料是反芻動(dòng)物最直接、有效的蛋白質(zhì)飼料替代品。

非蛋白氮雖然種類很多，然而能夠作為牛羊補(bǔ)充氮源的卻很有限。人們目前已對(duì)20多種可應(yīng)用于反芻動(dòng)物生產(chǎn)的非蛋白氮進(jìn)行了大量飼用試驗(yàn)，結(jié)果顯示飼養(yǎng)價(jià)值較好的是尿素和雙縮脲。普遍采用尿素添加在反芻動(dòng)物飼料中[1]。將尿素配制成混合料并制成顆粒料時(shí)，應(yīng)占混合料的1%～2%為宜，若含量超過(guò)3%，會(huì)影響飼料適口性，甚至可能導(dǎo)致中毒。Wang等[2]發(fā)現(xiàn)在杜泊雜交羊日糧中添加1.5%尿素對(duì)提高綿羊的生長(zhǎng)性能是安全有效的。張峰等[3]試驗(yàn)顯示，在綿羊日糧精料中添加2%包被尿素添加劑具有增進(jìn)食欲、提高生長(zhǎng)速度、經(jīng)濟(jì)效益明顯等特點(diǎn)。張嬌嬌等[4]在肉牛與異地育肥牦牛飼糧中添加 1%的緩釋尿素，發(fā)現(xiàn)肉牛與牦牛均獲得較小的料重比和較高的平均日增重。Ji 等[5]發(fā)現(xiàn)緩釋尿素作為肉羊濃縮飼料中大豆的替代品不應(yīng)超過(guò)4%，否則較高的劑量可能導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良和礦物質(zhì)代謝紊亂。Gardinal 等[6]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加2%的尿素組較10.6% 粗蛋白(CP)對(duì)照組和添加1%尿素組，降低了平均日增重。這些研究表明在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)中合理使用非蛋白氮飼料產(chǎn)品，可以達(dá)到節(jié)約蛋白飼料資源，降低飼料成本和提高動(dòng)物生產(chǎn)效率的目的。

目前關(guān)于非蛋白氮對(duì)反芻動(dòng)物的影響主要集中在生長(zhǎng)性能上，對(duì)生殖尤其是睪丸發(fā)育的研究還非常有限。徐詣軒等[7]對(duì)湖羊的研究發(fā)現(xiàn)，血氨和血尿素氮濃度隨尿素補(bǔ)充水平的提高而顯著升高。而較高的尿素氮和氨濃度可能會(huì)損傷精子、卵子和胚胎，改變母羊子宮內(nèi)的pH值，引起中間代謝改變、血糖、游離脂肪酸濃度變化，影響激素的生物合成，減少促黃體素與其受體的結(jié)合，降低了受胎率，導(dǎo)致繁殖力的下降，因此，血液中的尿素氮既反映了能氮平衡問(wèn)題，更反映了潛在的繁殖力[8]。

湖羊原產(chǎn)于太湖區(qū)域，具有許多優(yōu)良性狀如早熟、早期生長(zhǎng)快和繁殖力高，因而被廣泛引入到全國(guó)各地。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究日糧中添加不同水平的尿素對(duì)湖羊睪丸發(fā)育的影響，以期為非蛋白氮應(yīng)用于湖羊生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將70只3～4月齡、體重接近(24.3±1.7) kg的雄性湖羊(南京三六九養(yǎng)殖專業(yè)合作社)隨機(jī)分為5組，分別飼喂含有豆粕或不同水平尿素的日糧：低蛋白對(duì)照組(低蛋白飼糧，CP=11.6%)、高蛋白對(duì)照組(豆粕飼糧，CP=17.6%)、1%尿素組(低蛋白飼糧+1%尿素，CP=14.5%)、2%尿素組(低蛋白飼糧+2%尿素，CP=17.3%)、3%尿素組(低蛋白飼糧+3%尿素，CP=20.1%)。每組7個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只羊。預(yù)飼期1 周，正試期8周。試驗(yàn)結(jié)束后，采集血樣凍存，測(cè)量睪丸參數(shù)，并將睪丸組織固定。

由于2%尿素組與高蛋白對(duì)照組蛋白水平相當(dāng)，增重效果也相當(dāng)，因此本試驗(yàn)僅選取高蛋白對(duì)照組、低蛋白對(duì)照組、1%尿素組、3%尿素組進(jìn)行采樣。

1.2 日糧配方

試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn) (NY/T 816-2004)》進(jìn)行配制。各組日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 血清睪酮的測(cè)定

應(yīng)用放射免疫方法檢測(cè)血清睪酮濃度。由上海信帆生物技術(shù)有限公司測(cè)試，試劑盒靈敏度為0.02 ng/mL；精密度為批內(nèi)變異CV<10%，批間變異CV<15%。

1.3.2 睪丸表觀參數(shù)的測(cè)定

用卷尺和鋼尺測(cè)量睪丸長(zhǎng)徑、短徑、周徑；用天平稱取睪丸重量；計(jì)算睪丸指數(shù)，即雙側(cè)睪丸重(mg)和體質(zhì)量(g)的比值。

1.3.3 睪丸組織學(xué)觀察

將采集好的睪丸組織樣品經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、透蠟、包埋和切片制成睪丸組織切片，用蘇木素-伊紅染色法進(jìn)行染色。通過(guò)虛擬顯微鏡來(lái)觀察染色切片，分析睪丸組織的形態(tài)變化。根據(jù)它們的形狀分為精原細(xì)胞(SG)，初級(jí)精母細(xì)胞(PS)，圓形精子細(xì)胞(RST)，細(xì)長(zhǎng)型精子細(xì)胞(EST)。

表1 試驗(yàn)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平

項(xiàng)目高蛋白對(duì)照組低蛋白對(duì)照組1%尿素組2%尿素組3%尿素組原料組成/%玉米青貯25.0025.0024.7524.5124.27花生秧20.0020.0019.8019.6119.42玉米29.0042.0041.5841.1840.78豆粕17.004.003.963.923.88麩皮4.004.003.963.923.88預(yù)混料5.005.004.954.904.85尿素0.000.001.002.003.00營(yíng)養(yǎng)水平粗蛋白/%17.611.614.517.320.1中性洗滌纖維/%31.632.733.131.932.8酸性洗滌纖維/%20.720.421.320.820.9粗脂肪/%2.893.083.123.083.17灰分/%9.009.129.129.119.09消化能/(MJ·kg-1)13.613.813.613.513.4

注：每公斤預(yù)混料中所含成分：NaCl 150 g，NaHCO3200 g，Ca 75 g，P 20 g，Mn 600 mg，F(xiàn)e 680 mg，Zn 960 mg，Cu 300 mg，維生素A 140 kU，維生素D3 55 kU，維生素E 700 mg，煙酰胺600 mg。

1.3.4 曲細(xì)精管參數(shù)測(cè)量

用Image Pro Plus軟件測(cè)量曲細(xì)精管生精上皮厚度，每個(gè)睪丸組織樣本選取4個(gè)曲精小管截面測(cè)量，僅評(píng)估圓形和近圓形小管。通過(guò)小管外徑減去小管內(nèi)徑來(lái)計(jì)算生精上皮厚度[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2012處理后，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。各組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同非蛋白氮水平對(duì)湖羊睪丸重和睪丸指數(shù)的影響

由表2可知，2個(gè)對(duì)照組的睪丸重和睪丸指數(shù)相當(dāng)。補(bǔ)充1%尿素較低蛋白對(duì)照組睪丸重量下降14.89%(P=0.495)，睪丸指數(shù)下降18.13%(P=0.32)，差異不顯著。補(bǔ)充3%的尿素較低蛋白對(duì)照組睪丸指數(shù)下降12.34%(P=0.53)，差異不顯著。

補(bǔ)充1%尿素較高蛋白對(duì)照組睪丸重量下降11.34%(P=0.62)，睪丸指數(shù)下降16.25%(P=0.457)，差異不顯著。補(bǔ)充3%尿素較對(duì)照組睪丸指數(shù)下降10.33%(P=0.663)，差異不顯著。

2.2 不同非蛋白氮水平對(duì)湖羊睪丸長(zhǎng)徑、短徑和周徑的影響

由表3可知，各組間睪丸長(zhǎng)徑和短徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1%尿素組周徑較低蛋白對(duì)照組、3%尿素組和高蛋白對(duì)照組略有增加。

表2 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸重與睪丸指數(shù)

組別睪丸重/g睪丸指數(shù)低蛋白對(duì)照94.17±28.185.35±1.301%尿素80.83±36.534.38±1.873%尿素86.00±34.354.69±2.07高蛋白對(duì)照91.17±33.385.23±1.94

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

表3 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸長(zhǎng)徑、短徑和周徑 cm

組別長(zhǎng)徑短徑周徑低蛋白對(duì)照7.00±1.435.19±0.6111.92±2.161%尿素7.25±1.595.23±0.7912.17±2.253%尿素7.12±1.225.04±0.7411.68±2.26高蛋白對(duì)照7.25±1.485.13±0.7211.62±1.88

2.3 不同非蛋白氮水平對(duì)湖羊睪丸組織形態(tài)的影響

由圖1、2看出，低蛋白對(duì)照組的生殖細(xì)胞層數(shù)與其他組相比略少(圖1)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，低蛋白組管腔中細(xì)胞分化明顯，但胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡，空腔較大，PS、精子數(shù)量少。曲細(xì)精管邊緣皺縮、不規(guī)則(圖2A)。1%尿素組SG、PS、精子細(xì)胞和少數(shù)長(zhǎng)形精子細(xì)胞從曲細(xì)精管基底膜有序向中央排列(圖2B)。3%尿素組管壁到管腔排列整齊，細(xì)胞分化明顯，但只停留在精子細(xì)胞階段，無(wú)精子。少量曲細(xì)精管萎縮，邊緣皺縮、不規(guī)則，少量細(xì)胞脫落(圖2C)。高蛋白對(duì)照組管壁到管腔排列整齊，細(xì)胞分化明顯，有明顯的精子細(xì)胞，但精子較少。部分曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞變性，曲細(xì)精管邊緣皺縮、不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡(圖2D)。

A.低蛋白對(duì)照組；B. 1%尿素組；C. 3%尿素組；D.高蛋白對(duì)照組

圖1 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸組織學(xué)觀察

A.低蛋白對(duì)照組；B. 1%尿素組；C. 3%尿素組；D.高蛋白對(duì)照組

圖2 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸曲精細(xì)管觀察

2.4 不同非蛋白氮水平對(duì)湖羊睪丸曲精細(xì)管外徑、內(nèi)徑和生精上皮厚度的影響

由表4可知，低蛋白組睪丸曲精細(xì)管內(nèi)徑和生精上皮厚度均較1%尿素組、3%尿素組和高蛋白對(duì)照組有所下降。補(bǔ)充1%尿素較低蛋白組睪丸內(nèi)徑下降23.31%(P=0.035)。生精上皮厚度上升26.01%(P=0.082)。補(bǔ)充3%的尿素較低蛋白組睪丸內(nèi)徑下降19.59%，(P=0.205)，生精上皮厚度上升16.33%(P=0.343)。高蛋白對(duì)照組較低蛋白組內(nèi)徑下降15.57%(P=0.320)，生精上皮厚度上升17.88%，(P=0.410)，差異不顯著。說(shuō)明添加1%尿素可以顯著減小睪丸內(nèi)徑，生精上皮厚度有上升趨勢(shì)，而添加3%尿素對(duì)生精上皮厚度發(fā)育無(wú)顯著影響。

表4 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸外徑、內(nèi)徑和生精上皮厚度μm

組別外徑內(nèi)徑生精上皮厚度低蛋白對(duì)照183.36±6.5894.68±13.85a88.69±20.201%尿素184.37±3.3472.61±6.29b111.76±7.103%尿素179.30±8.4176.13±16.08a103.17±11.73高蛋白對(duì)照184.46±6.3679.94±19.51a104.52±24.77

2.5 不同非蛋白氮水平對(duì)湖羊血清睪酮的影響

血清睪酮濃度低蛋白對(duì)照組(1.18±0.99)ng·mL-1與1%尿素組(1.17±0.88)ng·mL-1相當(dāng)，高蛋白組(1.69±1.06)ng·mL-1與3%尿素組(1.74±1.41)ng·mL-1相當(dāng)。補(bǔ)充1%尿素較高蛋白對(duì)照組睪酮濃度下降30.77%，差異不顯著(P=0.292)。補(bǔ)充3%的尿素較低蛋白組睪酮濃度上升47.46%，但差異不顯著(P=0.392)。

3 討論

3.1 日糧非蛋白氮水平對(duì)反芻動(dòng)物性腺發(fā)育的影響

研究表明，蛋白質(zhì)缺乏通過(guò)下丘腦或垂體前葉干擾促黃體素和促卵泡素釋放影響動(dòng)物的繁殖機(jī)能[10]。Waghorn等[11]的試驗(yàn)結(jié)果表明飼喂低蛋白日糧(13.38% CP)會(huì)降低母羊排卵率。Butler等[12]曾報(bào)道，飼喂高蛋白日糧會(huì)增加血漿尿素的濃度，從而干撓孕酮誘發(fā)子宮內(nèi)膜正常的分泌活動(dòng)，導(dǎo)致異常的子宮微環(huán)境。對(duì)于雄性反芻動(dòng)物，日糧蛋白質(zhì)不足會(huì)導(dǎo)致青年公牛生長(zhǎng)發(fā)育受阻，性腺發(fā)育緩慢；成年公牛繁殖機(jī)能下降。公羊睪丸大小與生育力密切相關(guān)，提高幼畜的營(yíng)養(yǎng)水平可使其初情期提前到來(lái)。羅家寧[13]試驗(yàn)表明，高蛋白飼料(20% CP)可以提高西農(nóng)薩能種公羊睪丸周徑。

本試驗(yàn)不同蛋白水平的日糧(11.6%～20.1% CP)對(duì)湖羊睪丸重量影響不大，但含有不同水平(1%，3%)尿素的NPN日糧(14.5% CP，20.1% CP)的睪丸重量略有下降。不同蛋白水平對(duì)湖羊睪丸長(zhǎng)徑、短徑和周徑影響不大，與羅家寧[13]研究不一致，可能是品種差異所致。

3.2 日糧非蛋白氮水平對(duì)反芻動(dòng)物精子發(fā)生影響

李靜等[14]試驗(yàn)顯示高蛋白(17.99% CP)日糧可顯著提高公羊采精量、精子密度和有效精子數(shù)。張作仁等[15]試驗(yàn)表明，無(wú)論是否在配種期，種公羊的體質(zhì)和繁殖機(jī)能與營(yíng)養(yǎng)水平均呈正相關(guān)，營(yíng)養(yǎng)成分不平衡或缺少導(dǎo)致生殖器官機(jī)能減弱，性欲降低，精子數(shù)量減少，活力減弱，畸形精子增加。Guan等[16]研究表明低營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)(13.97% CP)會(huì)降低美利奴公羊射精量，導(dǎo)致精子在冷凍過(guò)程中DNA的損傷率增加，降低精子產(chǎn)量和活率。任婉麗等[17]研究表明，日糧不同蛋白質(zhì)水平(9.19% CP、11.41% CP、12.39% CP)對(duì)精液品質(zhì)有顯著的影響，提高日糧蛋白質(zhì)水平可使遼寧絨山羊種公羊的采精量和精子活力升高，精子畸形率下降，且中蛋白組的精子密度最高。Khalifa等[18]用蛋白質(zhì)含量豐富的埃及車軸草替代部分精料混合料飼喂公山羊，結(jié)果表明，飼喂750 g的埃及車軸草與飼喂500 g相比，精液品質(zhì)顯著提高，精子畸形率顯著降低。

雖然蛋白質(zhì)對(duì)于提高公畜繁殖性能有著重要的作用，但也并非是蛋白質(zhì)水平越高越好。蛋白質(zhì)水平過(guò)高會(huì)使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸和其他代謝產(chǎn)物，增加了肝腎的負(fù)擔(dān)，從而導(dǎo)致中毒，對(duì)動(dòng)物繁殖性能不利，導(dǎo)致精液的品質(zhì)下降。方立超等[19]通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)觀察到，蛋白質(zhì)水平過(guò)高(24% CP)，對(duì)處于性腺發(fā)育期的肉仔雞曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞的發(fā)育有一定的阻礙作用。有研究表明盡管日糧中提供高蛋白飼料能夠提高公畜精液密度，但是高蛋白水平同時(shí)也會(huì)使精子活力下降，對(duì)精子正常形態(tài)產(chǎn)生不良影響。當(dāng)日糧蛋白質(zhì)過(guò)剩時(shí)，過(guò)量的蛋白質(zhì)分解成氨基酸通過(guò)影響能量的平衡和營(yíng)養(yǎng)的分配而直接影響動(dòng)物繁殖[20]。

本試驗(yàn)中低蛋白組(11.6% CP)曲細(xì)精管內(nèi)生精上皮細(xì)胞層數(shù)和精子數(shù)較少，可能是由于其日糧蛋白質(zhì)水平未達(dá)到該階段湖羊的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(14%～15% CP)，而1%尿素組蛋白水平最接近營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，其睪丸切片效果最理想，有明顯的精子細(xì)胞和精子。3%尿素組與高蛋白組的蛋白質(zhì)水平都高于營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，其曲細(xì)精管雖然細(xì)胞分化排列整齊，但管內(nèi)精子較少，這與以上蛋白濃度過(guò)高影響繁殖機(jī)能的觀點(diǎn)基本一致。不同非蛋白氮(1%～3%)水平對(duì)湖羊曲細(xì)精管生精上皮發(fā)育差異并不顯著，可能是飼喂時(shí)間較短(2個(gè)月)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)提高日糧營(yíng)養(yǎng)水平等方法來(lái)提高公畜產(chǎn)生精子的效率和改善精液品質(zhì)，通常需在飼喂飼料后2至5個(gè)月才能表現(xiàn)出來(lái)[21]。

3.3 日糧非蛋白氮水平對(duì)反芻動(dòng)物生殖激素的影響

動(dòng)物飼喂高蛋白質(zhì)日糧導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氨、尿素及其他含氮化合物上升，造成機(jī)體氮不平衡，會(huì)加劇能量負(fù)平衡程度，影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)分配從而間接影響機(jī)體的生殖激素代謝。高產(chǎn)奶牛泌乳期新陳代謝加快，導(dǎo)致機(jī)體類固醇代謝加速導(dǎo)致孕酮濃度下降不利于胚胎存活。李紅宇等[10]試驗(yàn)研究表明高蛋白質(zhì)水平(17.8% CP)日糧降低了奶牛黃體功能，黃體在黃體期分泌孕酮能力下降，造成外周血漿中濃度含量降低。雄性動(dòng)物精子的形成受下丘腦-腺垂體-睪丸軸調(diào)節(jié)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮影響雄性生殖器官的發(fā)育、刺激生精上皮的發(fā)育和精子發(fā)生，調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌。本試驗(yàn)中，不同非蛋白氮水平對(duì)湖羊血液睪酮濃度影響不大，可能是試驗(yàn)樣本數(shù)較少，個(gè)體差異較大，使差異統(tǒng)計(jì)不顯著。

4 結(jié)論

在育成期湖羊飼料中添加1%～3%尿素對(duì)6月齡湖羊睪丸表觀參數(shù)沒(méi)有影響，但蛋白日糧過(guò)低會(huì)影響睪丸精子發(fā)生。添加1%尿素對(duì)湖羊睪丸精子發(fā)生效果最佳。