梅原，薛洋，于昊，姜志洋，申軍士，茆達干

(動物科學類國家級實驗教學示范中心/南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

蛋白質(zhì)是反芻動物營養(yǎng)水平的主要限制因素，但富含蛋白質(zhì)的豆科牧草卻不能被廣泛的種植，蛋白質(zhì)飼料又通常非常昂貴，不適合用于大規(guī)模飼養(yǎng)生產(chǎn)，設計低蛋白日糧不僅能夠有效降低飼料成本，也能減少排泄物中氮對環(huán)境的污染。據(jù)估計，到2020年我國蛋白飼料缺口將達到4 800萬噸，蛋白質(zhì)飼料資源的缺乏促使人們在生產(chǎn)中尋找新型蛋白質(zhì)原料，而眾多研究表明，非蛋白氮(non-protein nitrogen)飼料原料是反芻動物最直接、有效的蛋白質(zhì)飼料替代品。

非蛋白氮雖然種類很多，然而能夠作為牛羊補充氮源的卻很有限。人們目前已對20多種可應用于反芻動物生產(chǎn)的非蛋白氮進行了大量飼用試驗，結果顯示飼養(yǎng)價值較好的是尿素和雙縮脲。普遍采用尿素添加在反芻動物飼料中[1]。將尿素配制成混合料并制成顆粒料時，應占混合料的1%～2%為宜，若含量超過3%，會影響飼料適口性，甚至可能導致中毒。Wang等[2]發(fā)現(xiàn)在杜泊雜交羊日糧中添加1.5%尿素對提高綿羊的生長性能是安全有效的。張峰等[3]試驗顯示，在綿羊日糧精料中添加2%包被尿素添加劑具有增進食欲、提高生長速度、經(jīng)濟效益明顯等特點。張嬌嬌等[4]在肉牛與異地育肥牦牛飼糧中添加 1%的緩釋尿素，發(fā)現(xiàn)肉牛與牦牛均獲得較小的料重比和較高的平均日增重。Ji 等[5]發(fā)現(xiàn)緩釋尿素作為肉羊濃縮飼料中大豆的替代品不應超過4%，否則較高的劑量可能導致營養(yǎng)不良和礦物質(zhì)代謝紊亂。Gardinal 等[6]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加2%的尿素組較10.6% 粗蛋白(CP)對照組和添加1%尿素組，降低了平均日增重。這些研究表明在反芻動物飼養(yǎng)中合理使用非蛋白氮飼料產(chǎn)品，可以達到節(jié)約蛋白飼料資源，降低飼料成本和提高動物生產(chǎn)效率的目的。

目前關于非蛋白氮對反芻動物的影響主要集中在生長性能上，對生殖尤其是睪丸發(fā)育的研究還非常有限。徐詣軒等[7]對湖羊的研究發(fā)現(xiàn)，血氨和血尿素氮濃度隨尿素補充水平的提高而顯著升高。而較高的尿素氮和氨濃度可能會損傷精子、卵子和胚胎，改變母羊子宮內(nèi)的pH值，引起中間代謝改變、血糖、游離脂肪酸濃度變化，影響激素的生物合成，減少促黃體素與其受體的結合，降低了受胎率，導致繁殖力的下降，因此，血液中的尿素氮既反映了能氮平衡問題，更反映了潛在的繁殖力[8]。

湖羊原產(chǎn)于太湖區(qū)域，具有許多優(yōu)良性狀如早熟、早期生長快和繁殖力高，因而被廣泛引入到全國各地。本試驗在前人研究的基礎上，通過研究日糧中添加不同水平的尿素對湖羊睪丸發(fā)育的影響，以期為非蛋白氮應用于湖羊生產(chǎn)實踐提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

將70只3～4月齡、體重接近(24.3±1.7) kg的雄性湖羊(南京三六九養(yǎng)殖專業(yè)合作社)隨機分為5組，分別飼喂含有豆粕或不同水平尿素的日糧：低蛋白對照組(低蛋白飼糧，CP=11.6%)、高蛋白對照組(豆粕飼糧，CP=17.6%)、1%尿素組(低蛋白飼糧+1%尿素，CP=14.5%)、2%尿素組(低蛋白飼糧+2%尿素，CP=17.3%)、3%尿素組(低蛋白飼糧+3%尿素，CP=20.1%)。每組7個重復，每個重復2只羊。預飼期1 周，正試期8周。試驗結束后，采集血樣凍存，測量睪丸參數(shù)，并將睪丸組織固定。

由于2%尿素組與高蛋白對照組蛋白水平相當，增重效果也相當，因此本試驗僅選取高蛋白對照組、低蛋白對照組、1%尿素組、3%尿素組進行采樣。

1.2 日糧配方

試驗基礎日糧參照《肉羊飼養(yǎng)標準 (NY/T 816-2004)》進行配制。各組日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 血清睪酮的測定

應用放射免疫方法檢測血清睪酮濃度。由上海信帆生物技術有限公司測試，試劑盒靈敏度為0.02 ng/mL；精密度為批內(nèi)變異CV<10%，批間變異CV<15%。

1.3.2 睪丸表觀參數(shù)的測定

用卷尺和鋼尺測量睪丸長徑、短徑、周徑；用天平稱取睪丸重量；計算睪丸指數(shù)，即雙側(cè)睪丸重(mg)和體質(zhì)量(g)的比值。

1.3.3 睪丸組織學觀察

將采集好的睪丸組織樣品經(jīng)過固定、脫水、透明、透蠟、包埋和切片制成睪丸組織切片，用蘇木素-伊紅染色法進行染色。通過虛擬顯微鏡來觀察染色切片，分析睪丸組織的形態(tài)變化。根據(jù)它們的形狀分為精原細胞(SG)，初級精母細胞(PS)，圓形精子細胞(RST)，細長型精子細胞(EST)。

表1 試驗日糧配方及營養(yǎng)水平

項目高蛋白對照組低蛋白對照組1%尿素組2%尿素組3%尿素組原料組成/%玉米青貯25.0025.0024.7524.5124.27花生秧20.0020.0019.8019.6119.42玉米29.0042.0041.5841.1840.78豆粕17.004.003.963.923.88麩皮4.004.003.963.923.88預混料5.005.004.954.904.85尿素0.000.001.002.003.00營養(yǎng)水平粗蛋白/%17.611.614.517.320.1中性洗滌纖維/%31.632.733.131.932.8酸性洗滌纖維/%20.720.421.320.820.9粗脂肪/%2.893.083.123.083.17灰分/%9.009.129.129.119.09消化能/(MJ·kg-1)13.613.813.613.513.4

注：每公斤預混料中所含成分：NaCl 150 g，NaHCO3200 g，Ca 75 g，P 20 g，Mn 600 mg，F(xiàn)e 680 mg，Zn 960 mg，Cu 300 mg，維生素A 140 kU，維生素D3 55 kU，維生素E 700 mg，煙酰胺600 mg。

1.3.4 曲細精管參數(shù)測量

用Image Pro Plus軟件測量曲細精管生精上皮厚度，每個睪丸組織樣本選取4個曲精小管截面測量，僅評估圓形和近圓形小管。通過小管外徑減去小管內(nèi)徑來計算生精上皮厚度[9]。

1.4 統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2012處理后，使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，應用單因素方差分析進行顯著性檢驗。各組的試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同非蛋白氮水平對湖羊睪丸重和睪丸指數(shù)的影響

由表2可知，2個對照組的睪丸重和睪丸指數(shù)相當。補充1%尿素較低蛋白對照組睪丸重量下降14.89%(P=0.495)，睪丸指數(shù)下降18.13%(P=0.32)，差異不顯著。補充3%的尿素較低蛋白對照組睪丸指數(shù)下降12.34%(P=0.53)，差異不顯著。

補充1%尿素較高蛋白對照組睪丸重量下降11.34%(P=0.62)，睪丸指數(shù)下降16.25%(P=0.457)，差異不顯著。補充3%尿素較對照組睪丸指數(shù)下降10.33%(P=0.663)，差異不顯著。

2.2 不同非蛋白氮水平對湖羊睪丸長徑、短徑和周徑的影響

由表3可知，各組間睪丸長徑和短徑差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1%尿素組周徑較低蛋白對照組、3%尿素組和高蛋白對照組略有增加。

表2 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸重與睪丸指數(shù)

組別睪丸重/g睪丸指數(shù)低蛋白對照94.17±28.185.35±1.301%尿素80.83±36.534.38±1.873%尿素86.00±34.354.69±2.07高蛋白對照91.17±33.385.23±1.94

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

表3 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸長徑、短徑和周徑 cm

組別長徑短徑周徑低蛋白對照7.00±1.435.19±0.6111.92±2.161%尿素7.25±1.595.23±0.7912.17±2.253%尿素7.12±1.225.04±0.7411.68±2.26高蛋白對照7.25±1.485.13±0.7211.62±1.88

2.3 不同非蛋白氮水平對湖羊睪丸組織形態(tài)的影響

由圖1、2看出，低蛋白對照組的生殖細胞層數(shù)與其他組相比略少(圖1)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，低蛋白組管腔中細胞分化明顯，但胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡，空腔較大，PS、精子數(shù)量少。曲細精管邊緣皺縮、不規(guī)則(圖2A)。1%尿素組SG、PS、精子細胞和少數(shù)長形精子細胞從曲細精管基底膜有序向中央排列(圖2B)。3%尿素組管壁到管腔排列整齊，細胞分化明顯，但只停留在精子細胞階段，無精子。少量曲細精管萎縮，邊緣皺縮、不規(guī)則，少量細胞脫落(圖2C)。高蛋白對照組管壁到管腔排列整齊，細胞分化明顯，有明顯的精子細胞，但精子較少。部分曲細精管內(nèi)生精細胞變性，曲細精管邊緣皺縮、不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡(圖2D)。

A.低蛋白對照組；B. 1%尿素組；C. 3%尿素組；D.高蛋白對照組

圖1 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸組織學觀察

A.低蛋白對照組；B. 1%尿素組；C. 3%尿素組；D.高蛋白對照組

圖2 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸曲精細管觀察

2.4 不同非蛋白氮水平對湖羊睪丸曲精細管外徑、內(nèi)徑和生精上皮厚度的影響

由表4可知，低蛋白組睪丸曲精細管內(nèi)徑和生精上皮厚度均較1%尿素組、3%尿素組和高蛋白對照組有所下降。補充1%尿素較低蛋白組睪丸內(nèi)徑下降23.31%(P=0.035)。生精上皮厚度上升26.01%(P=0.082)。補充3%的尿素較低蛋白組睪丸內(nèi)徑下降19.59%，(P=0.205)，生精上皮厚度上升16.33%(P=0.343)。高蛋白對照組較低蛋白組內(nèi)徑下降15.57%(P=0.320)，生精上皮厚度上升17.88%，(P=0.410)，差異不顯著。說明添加1%尿素可以顯著減小睪丸內(nèi)徑，生精上皮厚度有上升趨勢，而添加3%尿素對生精上皮厚度發(fā)育無顯著影響。

表4 不同蛋白水平下育成期湖羊睪丸外徑、內(nèi)徑和生精上皮厚度μm

組別外徑內(nèi)徑生精上皮厚度低蛋白對照183.36±6.5894.68±13.85a88.69±20.201%尿素184.37±3.3472.61±6.29b111.76±7.103%尿素179.30±8.4176.13±16.08a103.17±11.73高蛋白對照184.46±6.3679.94±19.51a104.52±24.77

2.5 不同非蛋白氮水平對湖羊血清睪酮的影響

血清睪酮濃度低蛋白對照組(1.18±0.99)ng·mL-1與1%尿素組(1.17±0.88)ng·mL-1相當，高蛋白組(1.69±1.06)ng·mL-1與3%尿素組(1.74±1.41)ng·mL-1相當。補充1%尿素較高蛋白對照組睪酮濃度下降30.77%，差異不顯著(P=0.292)。補充3%的尿素較低蛋白組睪酮濃度上升47.46%，但差異不顯著(P=0.392)。

3 討論

3.1 日糧非蛋白氮水平對反芻動物性腺發(fā)育的影響

研究表明，蛋白質(zhì)缺乏通過下丘腦或垂體前葉干擾促黃體素和促卵泡素釋放影響動物的繁殖機能[10]。Waghorn等[11]的試驗結果表明飼喂低蛋白日糧(13.38% CP)會降低母羊排卵率。Butler等[12]曾報道，飼喂高蛋白日糧會增加血漿尿素的濃度，從而干撓孕酮誘發(fā)子宮內(nèi)膜正常的分泌活動，導致異常的子宮微環(huán)境。對于雄性反芻動物，日糧蛋白質(zhì)不足會導致青年公牛生長發(fā)育受阻，性腺發(fā)育緩慢；成年公牛繁殖機能下降。公羊睪丸大小與生育力密切相關，提高幼畜的營養(yǎng)水平可使其初情期提前到來。羅家寧[13]試驗表明，高蛋白飼料(20% CP)可以提高西農(nóng)薩能種公羊睪丸周徑。

本試驗不同蛋白水平的日糧(11.6%～20.1% CP)對湖羊睪丸重量影響不大，但含有不同水平(1%，3%)尿素的NPN日糧(14.5% CP，20.1% CP)的睪丸重量略有下降。不同蛋白水平對湖羊睪丸長徑、短徑和周徑影響不大，與羅家寧[13]研究不一致，可能是品種差異所致。

3.2 日糧非蛋白氮水平對反芻動物精子發(fā)生影響

李靜等[14]試驗顯示高蛋白(17.99% CP)日糧可顯著提高公羊采精量、精子密度和有效精子數(shù)。張作仁等[15]試驗表明，無論是否在配種期，種公羊的體質(zhì)和繁殖機能與營養(yǎng)水平均呈正相關，營養(yǎng)成分不平衡或缺少導致生殖器官機能減弱，性欲降低，精子數(shù)量減少，活力減弱，畸形精子增加。Guan等[16]研究表明低營養(yǎng)供應(13.97% CP)會降低美利奴公羊射精量，導致精子在冷凍過程中DNA的損傷率增加，降低精子產(chǎn)量和活率。任婉麗等[17]研究表明，日糧不同蛋白質(zhì)水平(9.19% CP、11.41% CP、12.39% CP)對精液品質(zhì)有顯著的影響，提高日糧蛋白質(zhì)水平可使遼寧絨山羊種公羊的采精量和精子活力升高，精子畸形率下降，且中蛋白組的精子密度最高。Khalifa等[18]用蛋白質(zhì)含量豐富的埃及車軸草替代部分精料混合料飼喂公山羊，結果表明，飼喂750 g的埃及車軸草與飼喂500 g相比，精液品質(zhì)顯著提高，精子畸形率顯著降低。

雖然蛋白質(zhì)對于提高公畜繁殖性能有著重要的作用，但也并非是蛋白質(zhì)水平越高越好。蛋白質(zhì)水平過高會使動物體內(nèi)產(chǎn)生大量的有機酸和其他代謝產(chǎn)物，增加了肝腎的負擔，從而導致中毒，對動物繁殖性能不利，導致精液的品質(zhì)下降。方立超等[19]通過對比試驗觀察到，蛋白質(zhì)水平過高(24% CP)，對處于性腺發(fā)育期的肉仔雞曲細精管內(nèi)生精細胞的發(fā)育有一定的阻礙作用。有研究表明盡管日糧中提供高蛋白飼料能夠提高公畜精液密度，但是高蛋白水平同時也會使精子活力下降，對精子正常形態(tài)產(chǎn)生不良影響。當日糧蛋白質(zhì)過剩時，過量的蛋白質(zhì)分解成氨基酸通過影響能量的平衡和營養(yǎng)的分配而直接影響動物繁殖[20]。

本試驗中低蛋白組(11.6% CP)曲細精管內(nèi)生精上皮細胞層數(shù)和精子數(shù)較少，可能是由于其日糧蛋白質(zhì)水平未達到該階段湖羊的營養(yǎng)標準(14%～15% CP)，而1%尿素組蛋白水平最接近營養(yǎng)標準，其睪丸切片效果最理想，有明顯的精子細胞和精子。3%尿素組與高蛋白組的蛋白質(zhì)水平都高于營養(yǎng)標準，其曲細精管雖然細胞分化排列整齊，但管內(nèi)精子較少，這與以上蛋白濃度過高影響繁殖機能的觀點基本一致。不同非蛋白氮(1%～3%)水平對湖羊曲細精管生精上皮發(fā)育差異并不顯著，可能是飼喂時間較短(2個月)，因為通過提高日糧營養(yǎng)水平等方法來提高公畜產(chǎn)生精子的效率和改善精液品質(zhì)，通常需在飼喂飼料后2至5個月才能表現(xiàn)出來[21]。

3.3 日糧非蛋白氮水平對反芻動物生殖激素的影響

動物飼喂高蛋白質(zhì)日糧導致機體內(nèi)氨、尿素及其他含氮化合物上升，造成機體氮不平衡，會加劇能量負平衡程度，影響機體營養(yǎng)分配從而間接影響機體的生殖激素代謝。高產(chǎn)奶牛泌乳期新陳代謝加快，導致機體類固醇代謝加速導致孕酮濃度下降不利于胚胎存活。李紅宇等[10]試驗研究表明高蛋白質(zhì)水平(17.8% CP)日糧降低了奶牛黃體功能，黃體在黃體期分泌孕酮能力下降，造成外周血漿中濃度含量降低。雄性動物精子的形成受下丘腦-腺垂體-睪丸軸調(diào)節(jié)，睪丸間質(zhì)細胞分泌的睪酮影響雄性生殖器官的發(fā)育、刺激生精上皮的發(fā)育和精子發(fā)生，調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌。本試驗中，不同非蛋白氮水平對湖羊血液睪酮濃度影響不大，可能是試驗樣本數(shù)較少，個體差異較大，使差異統(tǒng)計不顯著。

4 結論

在育成期湖羊飼料中添加1%～3%尿素對6月齡湖羊睪丸表觀參數(shù)沒有影響，但蛋白日糧過低會影響睪丸精子發(fā)生。添加1%尿素對湖羊睪丸精子發(fā)生效果最佳。