方家華，宋小云，胡 蓉，劉俊賢，許銀娥

0引言

青光眼是一種不可逆致盲性眼病，可導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮甚至失明，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是受損的主要靶細(xì)胞，其軸突組成視神經(jīng)。目前針對(duì)青光眼的主要治療方法是降低眼壓。但是，有研究顯示，即使患者眼壓降低到正常范圍內(nèi)，視神經(jīng)損害仍然繼續(xù)發(fā)展，因此需要給予神經(jīng)保護(hù)治療[1]。相對(duì)于單一靶點(diǎn)藥物，多靶點(diǎn)藥物具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用。雙七他克林是一種人工合成的多靶點(diǎn)藥物，具有抑制膽堿酯酶、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體、一氧化氮合酶、鈣通道等多種藥理作用[2]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙七他克林通過(guò)抑制NMDA受體抑制谷氨酸引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷[3-4]，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙七他克林對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[5]。美金剛胺是一種NMDA受體抑制劑，在美國(guó)已進(jìn)入青光眼視神經(jīng)保護(hù)的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但評(píng)估試驗(yàn)結(jié)束后被停止進(jìn)入Ⅳ期臨床試驗(yàn)，尚未應(yīng)用于臨床[6]。本研究通過(guò)制作青光眼大鼠動(dòng)物模型，觀察雙七他克林的視神經(jīng)保護(hù)作用，并與美金剛胺進(jìn)行對(duì)比。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康雄性SD大鼠24只，出生12wk，體質(zhì)量280～320g, 購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司(合格證號(hào)：1107271911002941),飼養(yǎng)溫度18℃～25℃，濕度40%～70%。主要試劑：雙七他克林購(gòu)自Cayman公司，美金剛胺購(gòu)自Sigma公司，鼠源性Brn3a一抗購(gòu)自Millipore公司，鼠源性βⅢ-tubulin一抗購(gòu)自Covance公司，羊抗鼠二抗(含488nm或546nm熒光探針)，Triton X-100購(gòu)自Dow公司。 主要儀器設(shè)備：冰凍切片機(jī)(Leica，CM1950)，熒光顯微鏡(Leica，AF6000)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2方法

1.2.1大鼠青光眼模型的制作將24只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、手術(shù)組、雙七他克林組和美金剛胺組，每組各6只。配置濃度為1.75mol/L的高滲氯化鈉溶液，用孔徑0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾后備用。手術(shù)組、雙七他克林組和美金剛胺組大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉，暴露右眼上鞏膜靜脈，在解剖顯微鏡下，用33G注射針插入到右眼上鞏膜靜脈，使用Hamilton微量注射器緩慢注射高滲氯化鈉溶液50μL，僅注射1次。模型制作后檢測(cè)眼壓，清醒狀態(tài)下，結(jié)膜囊點(diǎn)奧布卡因滴眼液表面麻醉后使用TonoPen眼壓計(jì)測(cè)量眼壓，每3d測(cè)量1次，若眼壓≥28mmHg，右眼眼壓比左眼高5mmHg，則視為模型制作成功[6]。對(duì)照組大鼠右眼僅進(jìn)行上鞏膜靜脈穿刺，不注射高滲氯化鈉溶液。

1.2.2給藥方式造模后，對(duì)照組和手術(shù)組大鼠給予正常飲水，雙七他克林組和美金剛胺組大鼠飲用水中每天分別添加0.5mg/kg雙七他克林和5mg/kg美金剛胺，持續(xù)5wk。

1.2.3免疫熒光染色造模后5wk，10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉大鼠，采用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，摘除右側(cè)眼球，分離角膜并將其放置在4%多聚甲醛中過(guò)夜，然后用10%、20%、30%蔗糖梯度脫水，包埋劑包埋后放入-80℃冰箱保存。用冰凍切片機(jī)制作經(jīng)過(guò)視神經(jīng)的切片，厚度5μm，每個(gè)眼球選取3張連續(xù)切片使用Brn3a抗體對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞染色，βⅢ-tubulin抗體對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突進(jìn)行染色。PBS漂洗3次，5%山羊血清(含0.2% Triton X-100)封閉1h。在4℃環(huán)境下，用Brn3a/βⅢ-tubulin一抗(稀釋比例1∶100)孵育24h。然后PBS漂洗3次，加入含DAPI的熒光二抗(稀釋比例1∶100)，在4℃環(huán)境下孵育24h。PBS漂洗3次，甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察拍照，對(duì)從一側(cè)鋸齒緣經(jīng)過(guò)視神經(jīng)到另一側(cè)鋸圖1青光眼模型大鼠的眼壓情況。

齒緣的所有Brn3a染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，選取離視神經(jīng)200μm的βⅢ-tubulin染色陽(yáng)性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突，用Image J軟件測(cè)量其厚度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若存在差異，則使用Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組與其他三組的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1青光眼模型大鼠的眼壓情況制作青光眼模型后，模型大鼠右眼眼壓均升高，造模3d后達(dá)到28.92±2.55mmHg，6d后達(dá)到32.45±3.66mmHg。造模后每3d檢測(cè)一次眼壓，連續(xù)監(jiān)測(cè)1mo，模型大鼠右眼眼壓均值均維持在28mmHg以上，且均比對(duì)側(cè)眼眼壓(20.34±0.31mmHg)高5mmHg及以上(圖1)，模型制作成功。

2.2青光眼模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞情況免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖2A)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)核層(INL)、外核層(ONL)細(xì)胞核DAPI染色均呈陽(yáng)性(藍(lán)色)。在GCL層可見(jiàn)兩種細(xì)胞，其中Brn3a染色陽(yáng)性和DAPI染色陽(yáng)性的細(xì)胞(黃色)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。對(duì)照組、手術(shù)組、雙七他克林組、美金剛胺組大鼠右眼從一側(cè)鋸齒緣經(jīng)過(guò)視神經(jīng)到另一側(cè)鋸齒緣的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)分別為119.50±8.26、79.83±9.58、109.00±7.04、107.33±8.57個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.31，P<0.01，圖2B)，其中手術(shù)組大鼠右眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，雙七他克林組和美金剛胺組大鼠右眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)亦少于對(duì)照組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.106、0.054)，表明雙七他克林和美金剛胺能夠抑制青光眼所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少。

2.3青光眼模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度情況免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖3A)，在GCL層相鄰的神經(jīng)纖維層可見(jiàn)βⅢ-tubulin染色陽(yáng)性的神經(jīng)纖維(綠色)。對(duì)照組、手術(shù)組、雙七他克林組、美金剛胺組大鼠右眼距離視神經(jīng)200μm的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度分別為13.40±0.60、6.64±0.50、12.26±0.78、10.13±1.19μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=80.527，P<0.01，圖3B)，其中手術(shù)組和美金剛胺組大鼠右眼視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度較對(duì)照組明顯變薄，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，雙七他克林組大鼠右眼視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度較對(duì)照組亦變薄，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)，表明雙七他克林能夠抑制青光眼所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層萎縮。

圖2 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 A：距離視神經(jīng)200μm的免疫熒光染色圖片(×100)。GCL：節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層。B：四組大鼠右眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目比較。bP<0.01vs對(duì)照組。

圖3 視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度 A：距離視神經(jīng)200μm的免疫熒光染色圖片(×100)。GCL：節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層。B：四組大鼠右眼視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度比較。bP<0.01vs對(duì)照組。

3討論

本研究使用大鼠青光眼模型，在飲用水中加入藥物，口服給藥，證實(shí)多靶點(diǎn)藥物雙七他克林對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以抑制神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目下降及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄，對(duì)青光眼模型大鼠具有視神經(jīng)保護(hù)作用。

青光眼造成的視神經(jīng)損傷是復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，視神經(jīng)及視網(wǎng)膜組織等受損后，無(wú)法通過(guò)細(xì)胞分裂、增生而代償?shù)蛲龌蛩劳龅纳窠?jīng)細(xì)胞[7]。多靶點(diǎn)藥物的藥理作用可能與神經(jīng)損傷具有一一對(duì)應(yīng)或多階段對(duì)應(yīng)關(guān)系，其神經(jīng)保護(hù)作用可能比單一靶點(diǎn)藥物好[8]。美金剛胺是NMDA受體阻止劑，其在體外實(shí)驗(yàn)及青光眼模型猴的實(shí)驗(yàn)中對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷具有抑制作用，但是在進(jìn)行到Ⅲ期臨床試驗(yàn)時(shí)被終止，未應(yīng)用于臨床。

雙七他克林是由抗阿爾茲海默癥的藥物他克林衍生而來(lái)，具有多種藥理作用。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)雙七他克林對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷有抑制作用，在視網(wǎng)膜缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)熒光金逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[3]，證實(shí)雙七他克林可以減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙七他克林可以抑制NMDA受體[4]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)和急性視網(wǎng)膜缺血性損傷實(shí)驗(yàn)后使用慢性青光眼模型研究雙七他克林的視神經(jīng)保護(hù)作用，并使用Brn3a抗體對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行染色，Brn3a在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)[9]。青光眼時(shí)眼壓升高，玻璃體谷氨酸濃度增加，激活細(xì)胞膜的NMDA受體，使大量鈣離子內(nèi)流，激活細(xì)胞凋亡酶，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致興奮性損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，雙七他克林和美金剛胺對(duì)青光眼大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少均有抑制作用，可能與抑制NMDA受體減少興奮性損傷有關(guān)。此外，雙七他克林的視神經(jīng)保護(hù)作用可能還與抑制一氧化氮合酶等藥理機(jī)制有關(guān)。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突向眼球后極部匯聚，組成視神經(jīng)，高眼壓使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡，軸突也發(fā)生萎縮，最終導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮。βⅢ-tubulin是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的特異性染色劑[10]，越臨近視神經(jīng)，軸突厚度越厚。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了離視神經(jīng)200μm距離的神經(jīng)纖維層厚度，結(jié)果顯示雙七他克林可以抑制神經(jīng)纖維層的萎縮，這與雙七他克林抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠青光眼模型證實(shí)，雙七他克林可以抑制青光眼所致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目下降及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄，對(duì)視神經(jīng)具有保護(hù)作用，這對(duì)臨床治療青光眼具有潛在意義。