張偉勇，楊美蘭，顏雯，曾統(tǒng)，劉煒，程佳

1中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院(深圳福田)老年病科(廣東深圳 518033)； 2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生化教研室(廣東廣州 510080)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種臨床表現(xiàn)為記憶認知和語言功能等障礙的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病的醫(yī)學(xué)機制尚未明確，是目前導(dǎo)致老年癡呆的主要原因[1]。隨著老年社會的到來和患病人數(shù)的劇增，對該病精準早期診斷及有效治療的生物靶點研究成為熱點。MicroRNAs是一種長約22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，為基因表達的重要調(diào)控因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有豐富的表達并可借助外泌體等跨越血腦屏障釋放到外周血，結(jié)合蛋白穩(wěn)定存在于外周血[2]。研究表明microRNAs參與老年退行性疾病的發(fā)生過程，其中microRNA-124在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面已經(jīng)有大量的研究，在血清中穩(wěn)定存在且其在循環(huán)血中的表達譜隨著機體病理生理情況的改變而變化[3-4]。理論上我們推測與AD病理密切相關(guān)的microRNA-124在血清中可能也存在差異表達。本研究通過檢測AD患者以及初診AD患者治療后不同時間與健康人的血清microRNA-124差異表達情況，試圖尋找和證明一種可能作為輔助診斷AD的早期生物標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月至2019年8月就診于中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院老年及神經(jīng)內(nèi)科門診的AD初步確診患者36例，選取同期體檢中心的健康體檢者共30例為研究對象。分為對照組和病例組：對照組30例，男女各15例，年齡59～76歲；病例組36例，男18例，女18例，年齡62～78歲。各組研究對象在性別年齡及受教育年限方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

診斷標準[5]：病例組入選標準符合美國精神疾病診斷及統(tǒng)計手冊第4版關(guān)于AD和血管性癡呆VD的診斷標準，所有患者均進行臨床檢查、精神狀態(tài)檢查(MMSE)量表測試積分≤26分。并符合國際疾病分類診斷標準第10次修訂及美國國立神經(jīng)疾病，語言障礙及卒中研究所和AD及相關(guān)疾病協(xié)會所制定的“很可能是AD”的診斷標準。

排除標準：(1)既往有腦血管疾病者及抑郁；(2)有顱腦外傷者；(3)合并心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病，精神病患者；(4) 處于晚期狀態(tài)的老年癡呆疾病；(5)有血液系統(tǒng)疾病者；(6) 血管性及其他原因所致癡呆；(7) 未知情同意者。正常對照組患者無血液病、惡性腫瘤、嚴重的肝腎功能不全、感染疾病等其他疾病。

組別例數(shù)性別(例)男女年齡(歲)教育年限(年)對照組30151566.1±1.36.9±1.1病例組36181865.3±1.57.2±1.5

1.2 方法

1.2.1 治療 病例組為通過常規(guī)的西醫(yī)治療方式進行治療，囑患者晚上睡前服用口服鹽酸多奈哌齊，1次/d，5 mg/次。

1.2.2 血清樣本的收集處理和存儲 病例組初診確診后采取靜脈血，以后復(fù)查在初診后1、2、3年不同時間點取靜脈血。正常對照組靜脈血來自來體檢中心健康體檢者，所有靜脈血均在3 h內(nèi)，于4℃、3 000 r/min離心10 min，提取血清后統(tǒng)一放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 芯片檢測 血清microRNA的提取按照操作說明提取分離試劑盒(廣州晶偉公司DP501)，采用吸附柱法提取血清microRNA。抽取每例初診組患者的等量RNA，充分混勻后抽提RNA進行microRNA芯片檢測，采用Agilent高通量基因芯片技術(shù)，采用GO和KEGG pathway富集分析，并與正常組的microRNA芯片檢測結(jié)果比較，數(shù)據(jù)通過Agilent GeneSpring GX software(version 11.5.1)進一步分析(NCBI對應(yīng)注冊號：NM_032567 NM_152689)，通過Volcano Plot篩選出顯著差異表達基因，Hierarchical clustering比較樣本間差異基因microRNAs表達水平。

1.2.4 血清microRNA-124水平檢測[6]Real-time PCR法驗證芯片檢測結(jié)果，按照試劑盒mirVanaTMPARISTM Kit(Ambion)說明書操作提取血清中的microRNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit(TaKaRa)引入Uni-miR qPCR Primer的位點，對樣品中的cDNA進行定量反應(yīng)。隨即采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)對目的片段進行兩步法擴增以準確定量。microRNA-124引物由武漢銳博公司提供。逆轉(zhuǎn)錄引物：microRNA-124，5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-TCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATT-3′；U6，5′-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′。PCR 引物設(shè)計：miR-124，正向5′-GCTAAGGCACGCGGTG-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ ；U6，正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。實時定量PCR檢測在LightCycler 1.5儀器(瑞士Roche公司) 進行。以2-ΔΔCt表示每個microRNA的相對表達量，每例樣本重復(fù)檢測5次，實驗過程中采用盲法研究。采用非參數(shù)方法受試者工作特征(ROC)曲線分析診斷AD的敏感度和特異度。分析microRNA-124相對水平變化與MMSE的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片檢測結(jié)果 通過芯片對8例AD患者和8例對照組(隨機在病例組與對照組選取)血清microRNA進行定量檢測，結(jié)果提示可篩選出22個AD相關(guān)的有明顯意義的差異表達microRNAs基因(P<0.05)，見圖1。16個表達下調(diào)的基因有microRNA-9、microRNA-200b、microRNA-124等；6個表達上調(diào)的是microRNA-3099、microRNA-762等。以兩組間microRNA表達量的差異倍數(shù)，即相對表達量(log2)的絕對值>2.0且t檢驗P<0.01為篩選標準，發(fā)現(xiàn)microRNA-124的表達水平在AD患者中顯著低于對照組(log2=-6.12，P=1.20×10-5)。

圖1 AD組與正常組差異 microRNAs 聚類圖

2.2 microRNA-124結(jié)果 AD初診時0.66±0.29，初診1年0.71±0.30，初診2年1.11±0.25，初診3年1.16±0.31，對照組1.96±0.33，與對照組比較，病例各組的microRNA-124水平明顯低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)，見圖2。兩組倍數(shù)差值為2.13。病例組初診時表達量僅為對照組的31%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.22，P<0.001)，結(jié)果與microRNA芯片檢測結(jié)果一致；而病例組在治療后不同時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：*與對照組比較P<0.05

2.3 microRNA-124對AD的診斷效能 當曲線下面積(AUC)為0.891 2[95%置信區(qū)間(CI)：0.839 1～0.913 1，P<0.000 1]，當截止值為1.215時，敏感度和特異度均為81.2%，見圖3。microRNA-124相對水平變化與MMSE呈負相關(guān)性(r=-0.506，P<0.000 1) 。

圖3 microRNA-124表達的ROC曲線

3 討論

AD是最常見的老年癡呆癥類型，主要病理表現(xiàn)以β淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑、tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)及大量神經(jīng)元死亡為特征，該病的特點為起病隱匿、病情呈漸進性不可逆的進展[7]。目前AD的臨床診斷主要依賴于神經(jīng)心理學(xué)評分和標志物檢測，由于缺乏早期客觀診斷依據(jù)，使得大多數(shù)患者在疾病早期未得到正規(guī)診治。體液標志物具有檢測便捷、易于標準化等特點更加適用于早期篩查。近年來，microRNAs特別是外周血microRNAs的研究成為熱點，有關(guān)AD患者血清microRNA-124的表達水平以及與臨床治療效果之間的關(guān)系研究極少。本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-124在AD患者血清中表達水平顯著低于健康人水平，并初步確定了通過microRNA-124輔助診斷AD的臨界值，為臨床診斷和治療提供進一步新基礎(chǔ)指標。

已有研究顯示AD患者某些特定血清的microRNA表達譜與正常老年人相比存在顯著差異。本研究在大樣本中采用候選基因策略，對與腦組織病理改變密切相關(guān)的microRNA-124在血清中的表達進行驗證，發(fā)現(xiàn)其表達病例各組明顯低于對照組，提示其可以作為AD潛在的生物學(xué)標志物。microRNA-124是目前發(fā)現(xiàn)在腦組織中表達最為豐富的microRNA，占腦組織中microRNAs總量的1/4，對神經(jīng)元的發(fā)育、分化具有重要作用。Li等[8]首次發(fā)現(xiàn)AD 患者腦組織中microRNA-124較正常老年人相比表達下降，其中發(fā)現(xiàn)在12例AD和10例正常對照老年人血清中驗證了這一結(jié)果。在AD發(fā)病過程中，腦灰質(zhì)和白質(zhì)中microRNAs的表達也是不同的，其中microRNA-124在灰質(zhì)中下調(diào)明顯。Yeom等[9]發(fā)現(xiàn)AD和輕度認知功能障礙的患者中microRNA-124表達水平下降，與本研究結(jié)果一致。文獻研究了血液中12種與AD 有關(guān)的microRNAs，其中microRNA-124也表達下降[8]。我們認為 microRNA-124可能通過以下相關(guān)機制影響AD的發(fā)生、發(fā)展：(1)Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)AD進程中腦組織的microRNA-124的表達出現(xiàn)不同程度減少，而同時淀粉蛋白前β位分解酶表達增加從而出現(xiàn)相應(yīng)的病理變化，認為microRNA-124可通過與靶基因BACE1 的3′端非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)結(jié)合調(diào)控的表達，繼而增加APP水解后Aβ生成與沉積導(dǎo)致AD的發(fā)生，并可能通過調(diào)節(jié)BACE1 參與加速該病的進展；(2)microRNA-124誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞周期阻滯并重新進入細胞周期，重新進入細胞周期是AD發(fā)病的早期事件甚至發(fā)生在Aβ和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成之前導(dǎo)致AD的發(fā)生；(3)microRNA-124還通過降低控制APP和淀粉樣斑塊形成解聚素基質(zhì)金屬蛋白酶(ADAM) 10的表達來影響AD的發(fā)生[11]；(4)文獻研究[12]還證實AD患者腦組織microRNA-124表達下降與老年斑下降相關(guān)。當然，microRNA-124影響AD的機制還需要多方研究。本結(jié)果充分顯示AD患者治療時間越長，microRNA-124相對表達水平越高，正常人高于AD患者，microRNA-124 水平與AD存在著顯著負相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示microRNA-124在AD 患者中的表達量顯著降低，可能作為AD 的一種潛在的生物標志物。我們認為盡管人體內(nèi)microRNA-124不是AD患者特異性血清標志物，但作為一種比較敏感的體液標志物對AD患者預(yù)后估測及治療效果鑒定是一個有效的參數(shù)，可作為預(yù)后標志之一。