丁 琳 王慧琴 凱迪麗亞·阿力甫 買爾哈巴·米吉提 吳衛(wèi)東

剝脫綜合征(exfoliation syndrome)是一種全身性的細(xì)胞外基質(zhì)疾病，與年齡相關(guān)。在眼部主要表現(xiàn)為無定形蛋白質(zhì)碎屑沉積于晶狀體前囊、基膜的其他眼組織上，沉積物呈灰白色或藍(lán)白色[1～3]?？衫^發(fā)青光眼，加速白內(nèi)障的進(jìn)展，并能增加術(shù)中和術(shù)后并發(fā)癥。目前剝脫綜合征的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究表明剝脫綜合征是一種多基因遺傳并受多因素調(diào)控的疾病，地區(qū)高發(fā)剝脫綜合征型白內(nèi)障患者的病情加速進(jìn)展及預(yù)后值得關(guān)注[4～6]。因此本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上就信號通路中重要的受體基因Notch2及其靶蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，試探討Notch2基因及其靶蛋白Notch2與剝脫綜合征白內(nèi)障發(fā)病的相關(guān)性。

對象與方法

1.研究對象：選取2016～2018年在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院眼科就診或住院的剝脫綜合征白內(nèi)障患者18例，其中，男性9例，女性9例；患者年齡45～79(68.17±10.42)歲。選擇同一時期來筆者醫(yī)院體檢的無相關(guān)病史的健康人群作為正常對照組，正常對照組18例，男女性別比為1∶1；年齡46～80歲(69.11±8.59)歲。采集研究對象外周血5～10ml。

2.納入、排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者參照Ritch R剝脫綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)；本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有患者或監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。兩組人群均排除眼科手術(shù)史、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、高血壓、糖尿病、強烈紅外線接觸史。女性患者排除妊娠、哺乳及月經(jīng)期。

3.外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離：將采集的靜脈血5ml注入盛有等量緩沖液的EP管中，充分混勻。將淋巴細(xì)胞分層液3ml加入EP管中，隨后注入稀釋抗凝血液沿管壁加至分層液上，保持兩者界面清晰。室溫2000r/min離心20min，管內(nèi)可分為4層。輕輕吸出乳白色的單個核細(xì)胞層，加入另一支已含有4ml PBS的離心管中混勻。室溫下，1500r/min離心10min。棄上清，重復(fù)洗滌1次。

4.Notch2基因表達(dá)量的檢測：(1)提取總RNA：按MiRNeasy Mini kit提取試劑盒(德國凱杰公司)說明書進(jìn)行，收集外周血單個核細(xì)胞，然后按步驟添加試劑提取樣本總RNA。用超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司)測定提取物濃度及純度，A260/A280比值為1.8～2.2，用于后續(xù)實驗。(2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：使用miScript Ⅱ RT kit(德國凱杰公司)，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，上樣于Bio-Rad C1000 Touch PCR 儀(美國伯樂公司)。反應(yīng)體系20μl：5×HIFlex Buffer 4μl，10×Nucleics Mix 2μl，RT Enzyme Mix 2μl，Total RNA(濃度約20mg/L)+RNase-Free H2O2共12μl。反應(yīng)條件：37℃ 60min，95℃ 5min。(3)實時熒光定量PCR反應(yīng)：應(yīng)用QuantiFast SYBR?Green PCR kit 試劑盒(德國凱杰公司)，引物購自德國凱杰成品序列，其引物序列為專利產(chǎn)品。反應(yīng)體系20μl：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10×miScript Primer Assay 2μl，10×miScript Universal Primer 2μl，RNase-Free H2O25μl，模板cDNA 1μl。反應(yīng)在熒光定量PCR儀(Rotor Gene-Q德國)上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃ 15min，1個循環(huán)；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個循環(huán)。每個樣本做3個復(fù)孔，在相同反應(yīng)條件下同時檢測Notch2和GAPDH的擴(kuò)增情況，程序運行結(jié)束后利用Rotor-Gene Q Series Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

5.免疫印跡法檢測Notch2蛋白表達(dá)量：將RIPA裂解液加入所收集的單個核細(xì)胞團(tuán)中，提取蛋白，BCA法測定蛋白提取物濃度。12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳；蛋白樣本分離轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%蛋白質(zhì)干粉TBST封閉1h；TBST洗膜10min 3次，Notch2一抗(美國Abcam公司)1∶1000室溫孵育1h；TBST洗膜10min 3次，二抗1∶1000室溫孵育1h；TBST洗膜10min 3次，曝光獲得灰度。

結(jié) 果

1.實時熒光定量PCR曲線分析：以GAPDH擴(kuò)增作為參照，樣本Notch2基因熒光定量擴(kuò)增特異性好，擴(kuò)增效率良好(圖1)。Notch2基因在正常人群和剝脫綜合征白內(nèi)障患者中的表達(dá)水平分別為0.035±0.033、0.157±0.137，剝脫組中Notch2的表達(dá)高于正常組人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.662，P=0.002)。

2.免疫印跡檢測Notch2蛋白表達(dá)：剝脫綜合征白內(nèi)障患者Notch2蛋白的相對表達(dá)量為0.785±0.092，正常人群Notch2表達(dá)量為0.304±0.091，剝脫組Notch2蛋白表達(dá)量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.795，P=0.000,圖2)。

圖1 實時熒光定量PCR檢測Notch2基因的擴(kuò)增曲線圖和溶解曲線圖A.Notch2擴(kuò)增曲線圖;B.Notch2溶解曲線圖

圖2 Notch2蛋白Western blot法表達(dá)水平比較圖與正常人群比較，*P<0.01

討 論

Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，由于其基因突變可以引起果蠅出現(xiàn)殘翅的現(xiàn)象因而命名。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，Notch基因廣泛表達(dá)于無脊椎動物及哺乳動物體內(nèi)[7～9]。Notch基因?qū)儆诳缒な荏w蛋白家族，其受體蛋白分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),結(jié)合配體并激活受體的部位是胞外區(qū)。Notch信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)可直接接受臨近細(xì)胞的信號，不需通過第二信使和蛋白激酶的參與來完成。信號由此轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[7～10]。Notch信號通路在進(jìn)化上具有高度保守性，參與多個系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、功能等生物學(xué)活動[9～11]。研究表明Notch信號通路在胚胎發(fā)育、血管形成、血細(xì)胞形成以及腫瘤發(fā)生等的生理、病理過程中發(fā)揮重要作用[7～11]。Notch2是Notch信號通路的重要受體蛋白，其與配體結(jié)合后可酶切暴露的金屬酶切位點，釋放出胞內(nèi)NICD。NICD進(jìn)入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL/CBF1結(jié)合活化Hes，從而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)調(diào)控，影響細(xì)胞增殖、凋亡等過程[12～18]。剝脫綜合征是一種受多基因調(diào)控，受多因素作用的系統(tǒng)性疾病，其眼部病變表現(xiàn)為不明纖維物質(zhì)在眼部組織中沉積，引起房水外流受阻，從而導(dǎo)致眼壓增高和視神經(jīng)受損，并最終發(fā)展為青光眼和白內(nèi)障等疾病，嚴(yán)重者可致盲[1～5]。

目前研究認(rèn)為剝脫綜合征是由遺傳、環(huán)境、年齡等多因素引起的細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常性疾病[1]。在前期工作基礎(chǔ)上筆者推測信號通路重要受體Notch2參與了眼部疾病的發(fā)生，因此本研究以Notch2為切入點通過進(jìn)行實時熒光定量PCR來檢測其在剝脫綜合征白內(nèi)障患者與正常人群外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)，并對其下游靶蛋白Notch2展開研究，以此探尋剝脫綜合征白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展可能的影響因素。

綜上所述，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，Notch2在剝脫組中的表達(dá)顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.662，P<0.01)，推測Notch2在剝脫綜合征白內(nèi)障患者外周血單個核細(xì)胞中的高表達(dá)可能調(diào)控了細(xì)胞異常代謝過程，從而參與了剝脫綜合征的發(fā)展過程，進(jìn)而加速影響白內(nèi)障惡化進(jìn)程。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，Notch2蛋白在剝脫組中的表達(dá)高于正常人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.795,P<0.01)，受Notch2基因調(diào)控其靶蛋白也異常表達(dá)。參與這一系列過程可能調(diào)控了信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)異常分泌，從而加速病理過程。與正常人群比較，剝脫綜合征白內(nèi)障患者外周血單個核細(xì)胞中Notch2基因呈高表達(dá)，同時Notch2蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，這說明二者呈正相關(guān)。由整體實驗結(jié)果推測Notch2基因及其靶蛋白的差異表達(dá)共同作用參與了剝脫綜合征白內(nèi)障的發(fā)展過程。