李肖飛，徐琬梨

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是由于女性在絕經(jīng)后激素水平快速下降從而導(dǎo)致骨含量降低而出現(xiàn)的。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是女性需要重點(diǎn)關(guān)注的疾病，其對女性的健康存在重要的影響，引起了社會上的廣泛關(guān)注。本文對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的常見證素以及正常對照組進(jìn)行代謝組學(xué)分析，以期為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床診斷及預(yù)防提供生物學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集在山東中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院山東省中醫(yī)院骨科2016年12月－2017年10月住院并測定骨密度確定為骨質(zhì)疏松癥的患者，并通過證候辨證素量表測得絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥常見實(shí)性證素（腎虛組、痰濕組、腎虛氣滯組、腎虛痰濕組、腎虛血瘀組），以及空白對照組患者。各組在年齡、性別、絕經(jīng)年齡等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《原發(fā)性骨質(zhì)疏松指南（2017）》[1]擬定。1）女性絕經(jīng)1年以上；2）骨質(zhì)疏松癥診斷主要參考脆性骨折程度或DXA骨密度測量結(jié)果，T-值≤-2.5可診斷為骨質(zhì)疏松；3）既往無糖尿病、甲亢、甲旁亢等影響骨代謝性疾病、血液系統(tǒng)疾病、慢性肝腎功能不全、惡性腫瘤疾病史及無長期接受糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療。

1.3 證素診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)中醫(yī)理論和辨證思維規(guī)律，參照《證素辨證學(xué)》[2]，根據(jù)中醫(yī)診斷整體審察、四診合參的原則，對證候、證素進(jìn)行文獻(xiàn)查閱、數(shù)據(jù)分析，對其2者所存在的從屬關(guān)系，進(jìn)行量化標(biāo)值，從而制定出“證候辨證素量表”。通過臨床信息采集對患者進(jìn)行量表的測評，根據(jù)四診進(jìn)行判斷各個(gè)證候，以明確在證素診斷中所占的評分比重，以各證候的評分總分來確定證素。取病位證素腎，以腎虛為主要臨床表現(xiàn)，綜合實(shí)性證素血瘀、氣滯、痰濕，分為腎虛組、痰濕組、腎虛血瘀組、腎虛氣滯組、腎虛痰濕組，每組各30例。

1.4 血清采樣方法 晨時(shí)空腹取血，室溫下離心5 min后取血清，至-80℃的冰箱進(jìn)行分組儲存。

1.5 樣本預(yù)處理 將血樣樣本在室溫下解凍，取血樣樣本400 μL放于1.5 mL離心管中，加入30 μL緩沖液和170 μL水，斡旋混勻，震蕩混勻后在4 ℃的條件下離心10 min，取500 μL上清液至核磁管中待檢。

1.6 H-NMR數(shù)據(jù)采集及處理 H-NMR 實(shí)驗(yàn)所用儀器是Varian 600MHz 譜儀，其1H共振頻率是599.93 MHz。橫向弛豫加權(quán)實(shí)驗(yàn)是用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，弛豫延遲2.0 s，采集時(shí)間1.5 s，譜寬12 000.0 Hz，溫度25 ℃，總回波時(shí)間100 ms，累加次數(shù)64次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用MestReNova 9.0.1對H-NMR采集處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，主要包括主成分分析（PCA），進(jìn)一步用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）優(yōu)化組間差異，通過對OPLS-DA模型各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分析，對有統(tǒng)計(jì)意義的差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步歸納。

2 結(jié)果

2.1 H-NMR譜圖預(yù)處理 對各組血清的譜圖使用MestReNova V9.0.1進(jìn)行相位調(diào)整、傅立葉變換、基線定標(biāo)及校正等處理[3]，結(jié)果顯示見圖1。通過分析圖譜可知各組之間存在差異代謝物，繼續(xù)采用多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，包括PCA、PLS-DA和OPLS-DA。

本研究中主要研究A、C、D、E、F組之間的差異。通過檢索代謝組學(xué)H-NMR譜相關(guān)化學(xué)位移譜數(shù)據(jù)庫，可知各組血清的差異代謝物主要如下。1-MH：1-甲基丁酸；3-HB：3-羥基丁酸；AA：乙酰乙酸；Ace：乙酸；Act：內(nèi)酯；Ala：丙氨酸；Cho：膽堿；Cit：檸檬酸；Cr：肌酸；DMA：二甲基賴氨酸；DMG：N，N-二甲基甘氨酸；EA：乙醇胺；Eth：乙醇；For：甲酸；Glc：葡萄糖；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；G：丙三醇l；GPC：甘油磷酸膽堿；HDL：高密度脂蛋白；HX：次黃嘌呤；IB：異丁酸；Ile：異亮氨酸；L1：低密度脂蛋白,CH3-（CH2）n-；L2：極低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L3：低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L4：極低密度脂蛋白，CH3-（CH2）n-；L5：極低密度脂蛋白，-CH2-CH2-C=O；L6：脂質(zhì)，-CH2-CH=CH-；L7：脂質(zhì)，-CH2-C=O；L8：脂質(zhì)，=CH-CH2-CH=；L9：脂質(zhì)，-CH=CH-；Lac：乳酸鹽；Leu： 亮氨酸；Lys：賴氨酸；M： 丙二酸；Met： 甲硫氨酸；Mol： 甲醇；m-I：肌醇；NAG：N-乙酰糖蛋白；PC：磷酸膽堿；Phe： 苯丙氨酸；Py：丙酮酸；Sar： 肌氨酸；Suc：琥珀酸鹽；Thr：蘇氨酸；TMAO： 三甲胺；Tyr： 酪氨酸；Val： 纈氨酸。

2.2 主要成分分析 PCA可以更好的揭示各組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更明確的說明各組數(shù)據(jù)變量。使用SIMCA 14.1，對實(shí)性證素各組結(jié)果進(jìn)行對數(shù)（LOG）轉(zhuǎn)換加UV格式化處理，然后進(jìn)行自動建模分析[4]。從A、F組，A、E組，A、D組，A、C組之間PCA得分圖的結(jié)果可以看出，2組樣本區(qū)分不顯著，樣本大部分處于99%置信區(qū)間（Hotelling’s T-squared ellipse）內(nèi)，此數(shù)據(jù)值得進(jìn)一步研究。

2.3 正交偏最小二乘法一判別分析（PLS-DA）及對模型的驗(yàn)證 為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可視化和后續(xù)分析，采用OPLS-DA的方法進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。使用SIMCA 14.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行LOG轉(zhuǎn)換加UV格式化處理[5-6]，表明各組之間模型可靠，并且各組血清代謝模式發(fā)生改變?？芍狢、A組，D、A組，E、A組，F(xiàn)、A組各組之間的置換檢驗(yàn)結(jié)果表明各組模型的R2接近1，表明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況Q2接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到近似的分布情況，總的來說各組的原模型可以很好地解釋2組樣本之間的差異。

圖1 各組血清譜峰歸屬圖

2.4 差異代謝物的篩選 通過對OPLS-DA模型各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分析，對有統(tǒng)計(jì)意義的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步歸納。對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理時(shí)，先將相關(guān)系數(shù)圖中的所有變量的Loading值乘以其標(biāo)準(zhǔn)偏差后，進(jìn)行回溯轉(zhuǎn)換對各組的數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)的絕對值與0.361進(jìn)行對比，最終篩選獲得導(dǎo)致各組之間存在差異的代謝產(chǎn)物[7-8]。見表1。

結(jié)果顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的腎虛組與正常對照組，腎虛氣滯組與正常對照組，腎虛血瘀組與正常對照組，腎虛痰濕組與正常對照組之間的血清代謝成份存在明顯的差異。1）PMOP腎虛組與正常對照組主要的差異代謝物為乙醇胺、甲酸鹽、次黃嘌呤、異亮氨酸、丙二酸鹽、酪氨酸、纈氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2）PMOP腎虛氣滯組與正常對照組主要的差異代謝物為肌酸、乙醇胺、甲酸、谷氨酰胺、異丁酸、異亮氨酸、乳酸鹽、低密度脂蛋白、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3）PMOP腎虛血瘀組與正常對照組主要的差異代謝物為乙醇胺、甲酸、異丁酸、異亮氨酸、低密度脂蛋白、亮氨酸、丙二酸鹽、酪氨酸、纈氨酸，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4）PMOP腎虛痰濕組與正常對照組主要的差異代謝物為甲酸、甘油、丙酮酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同組對間血清主要差異代謝物及其OPLS-DA相關(guān)系數(shù)

3 討論

通過對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥實(shí)性證素進(jìn)行HNMR的代謝組學(xué)研究，血清樣本的譜圖上有很多不同的尖銳譜峰，并且通過PCA、PLS-DA、OPLS-DA的分析，可知腎虛組與正常對照組，腎虛氣滯組與正常對照組，腎虛血瘀組與正常對照組，腎虛痰濕組與正常對照組之間存在明顯的差異代謝物。

3.1 腎虛組與正常對照組的差異代謝物分析 乙醇胺與糖酵解有關(guān)，乙醇胺是磷脂代謝的產(chǎn)物，磷酸是體內(nèi)各種物質(zhì)代謝不可缺少的物質(zhì)，乙醇胺的增加說明磷脂代謝的增加，磷脂代謝與腎病糖尿病相關(guān)，其乙醇胺的增多反應(yīng)其病位腎部位的病理變化[9]。亮氨酸、異亮氨酸是支鏈氨基酸,能夠促進(jìn)和抑制蛋白質(zhì)合成、分解，并且參與糖代謝過程，與機(jī)體能量代謝有關(guān)[10]。低密度脂蛋白參與脂代謝的運(yùn)程，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，其含量的降低說明體內(nèi)脂代謝運(yùn)程的降低。纈氨酸與體外細(xì)胞免疫有關(guān)[11]。說明腎虛組的能量代謝較慢，PMOP腎氣虛患者會影響能量代謝、脂代謝的進(jìn)程，腎虛證的表現(xiàn)與代謝物的異常相符合，并且表明PMOP腎虛患者的細(xì)胞外免疫力下降。甲酸是甲醇的代謝產(chǎn)物，甲醇經(jīng)過肝臟的代謝生成甲酸。生成的甲酸最初會聚集于眼部，破壞視覺神經(jīng)，造成視覺上的變化，后期隨著身體氣血循環(huán)進(jìn)入血液會使組織酸性變強(qiáng)，進(jìn)而損害腎臟，造成腎臟功能的降低。BROSNAN等[12]研究發(fā)現(xiàn)甲酸由多種代謝源產(chǎn)生，主要用于嘌呤合成，通過對葉酸缺乏大鼠甲酸鹽代謝的研究表明，葉酸缺乏導(dǎo)致甲酸鹽產(chǎn)生率降低，同時(shí)血漿甲酸鹽濃度升高。研究[13]表明葉酸水平的升高會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，因此甲酸含量的上升與骨質(zhì)疏松癥存在關(guān)聯(lián)。

3.2 腎虛氣滯組與正常對照組的差異代謝物分析 肌酸是甘氨酸的衍生物，在能量代謝上具有重要作用。其存在于肌肉中，與人體運(yùn)動、力量、恢復(fù)等相關(guān)[14]。谷氨酸含量的降低與人體疼痛反應(yīng)降低相關(guān)[11]。乳酸是糖異生循環(huán)中的主要原料，乳酸含量的異常說明PMOP腎虛氣滯患者由于氣機(jī)的阻滯使循環(huán)系統(tǒng)受到影響[15]。賴氨酸是所有慢性病常見的代謝物，苯丙氨酸主要在肝臟等組織中代謝成酪氨酸，參與酪氨酸降解途徑[16]，其含量的異常說明PMOP是一種慢性疾病。中醫(yī)學(xué)中氣滯的發(fā)生多與肝臟有關(guān)，因此PMOP腎虛氣滯組相比對照組會影響糖代謝、氨基酸代謝等方面，尤其在于氨基酸代謝的紊亂，并且其代謝物的異常提示對人體消炎鎮(zhèn)痛方面存在影響。

3.3 腎虛血瘀組與正常對照組的差異代謝物分析 酪氨酸是合成兒茶酚胺類遞質(zhì)的前體，兒茶酚胺遞質(zhì)可以緩解疼痛達(dá)到消炎鎮(zhèn)痛的目的，酪氨酸含量的異常表明PMOP患者需要該類物質(zhì)來達(dá)到自身修復(fù)的作用[17]，說明PMOP血瘀組患者所表現(xiàn)出來的刺痛與體內(nèi)酪氨酸的增多有關(guān)。PMOP腎虛血瘀組的乙醇胺的含量也是上升的，表明對于PMOP的患者的糖代謝有影響。該組低密度脂蛋白差異代謝值較其他組上升最大，LDL水平的增高說明脂代謝的異常，脂肪不完全氧化程度高，血液運(yùn)行緩慢，低密度脂蛋白的上升則與血瘀證相符[18]。纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸的含量也是上升的，其都屬于氨基酸代謝[19]，多于肝臟進(jìn)行，同樣表明血瘀的發(fā)生與肝存在聯(lián)系。

3.4 腎虛痰濕組與正常對照組差異代謝物分析 葡萄糖進(jìn)行有氧糖酵解，1分子的葡萄糖可以提供2 mol ATP和2分子的丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸，丙酮酸與人體的能量代謝相關(guān)[10]，另一方面丙酮酸與激素的形成存在關(guān)聯(lián)，而PMOP發(fā)生的重要原因是激素水平紊亂，因此丙酮酸含量的異常也會導(dǎo)致PMOP的發(fā)生。α-葡萄糖，β-葡萄糖也是細(xì)胞能量來源的產(chǎn)物以及中間的代謝物[20]，說明PMOP腎虛痰濕組的糖代謝較為迅速，糖異生的過程加快，中間產(chǎn)生乳酸含量較低，表明一方面痰濕證會令人感到乏力，疲倦的感覺[21]。另一方面，痰濕證會阻礙布散人體所需的精微物質(zhì)。

4 結(jié)論

通過對PMOP各組以及正常對照組血清的差異代謝物進(jìn)行研究分析，可知PMOP各組與正常組是可以區(qū)分的，涉及19種差異代謝物，其中甲酸代謝物的變化與各組都相關(guān)，可能是PMOP較為明顯的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。為PMOP的發(fā)病機(jī)理研究提供了生物學(xué)上的支持，提示在PMOP的研究中應(yīng)把重點(diǎn)放在甲酸代謝物方面，分析其所在通路以及所涉及基因，也表明生活中出現(xiàn)一些疼痛以及飲食異常的情況要加以重視。本實(shí)驗(yàn)研究主要用的是HNMR技術(shù)，只能檢測小部分血清代謝物，以后的研究中可以進(jìn)一步采取CS-MS、LC-MS的檢測，來提高檢測的準(zhǔn)確性，為PMOP研究發(fā)病機(jī)理提供生物學(xué)依據(jù)。